姜黃素對腎癌ACHN細(xì)胞增殖與凋亡的影響及作用機(jī)制*

陳烈鉗, 謝進(jìn)東, 黃棟強(qiáng), 陳景宇

惠州市第一人民醫(yī)院泌尿外科(廣東惠州 516000)

腎臟腫瘤是泌尿系統(tǒng)主要疾病之一，其中90%是惡性的，又稱為腎細(xì)胞癌(RCC)。RCC是成人常見的惡性腫瘤，并且發(fā)病率逐年增加[1]。盡管腎癌早期患者通過手術(shù)治療后愈后效果較好，但患有復(fù)發(fā)性或新發(fā)轉(zhuǎn)移性疾病的患者通常無法治愈并且需要全身治療。此外，由于RCC具有多種耐藥基因，使其對放療、化療均不敏感。因此，找到低毒性并具有高效抗癌作用的活性物質(zhì)成為目前的研究熱點(diǎn)。姜黃素是一種從姜科植物的根莖中提取得到的黃色色素，為酸性多酚類物質(zhì)，主鏈為不飽和脂族及芳香族基團(tuán)[2]。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、抗動脈粥樣硬化、抗類風(fēng)濕、降脂、抗衰老、消除自由基及抗腫瘤等作用[3]。近年來，越來越多的研究證明，Notch信號通路參與多種腫瘤生物學(xué)行為的調(diào)控，包括腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和基因組穩(wěn)定性。一些研究已經(jīng)證實(shí)，Notch1蛋白及其mRNA在RCC組織中的表達(dá)高于鄰近組織[4]。另外有研究表明，姜黃素作用于ACHN細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)密度降低，細(xì)胞形態(tài)縮小，變圓等凋亡的特征[5]。因此，我們于2019年3月至2020年12月開展實(shí)驗(yàn)研究姜黃素作用于腎癌ACHN細(xì)胞后對其增殖及凋亡的改變，探討其影響凋亡的可能機(jī)制，為腎癌治療的新方向提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 腎癌ACHN細(xì)胞購自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)和凍存。姜黃素購自碧云天生物公司，溶解于二甲基亞砜(DMSO)；MEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibgo公司; Cell Counting Kit-8試劑盒購自日本Dojindo公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；活性氧檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)所；Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；Bcl-2抗體、Caspase-3抗體及GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株的培養(yǎng)與傳代 ACHN細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，每2 d更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)板以上時利用1%胰蛋白酶進(jìn)行消化及傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖測定 取對數(shù)生長期的ACHN細(xì)胞，胰酶消化、離心后按照5×103個/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，100 μmol/L，四周邊緣用PBS填充，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，分別以0、10、20、40、80 μmol/L 姜黃素處理ACHN細(xì)胞，每個劑量設(shè)5個復(fù)孔，同時分別設(shè)置溶劑對照組(10、20、40、80 μmol/L姜黃素)及不加細(xì)胞和藥物的空白對照組(0 μmol/L)。分別處理12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃避光溫育2 h，全自動酶標(biāo)儀測量450 nm波長處各孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖情況，獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.3 細(xì)胞凋亡測定 取對數(shù)生長期的ACHN細(xì)胞，胰酶消化、離心后計(jì)數(shù)，按照5×105個細(xì)胞/皿的密度接種細(xì)胞至60 mm培養(yǎng)皿中，預(yù)培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度(0、20、40、80 μmol/L)的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。預(yù)冷PBS小心洗滌2遍，棄上清，按照試劑盒說明加入500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻；室溫下避光反應(yīng)10 min后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白表達(dá)水平檢測 胰酶消化、離心后計(jì)數(shù)，按照5×105個/皿接種細(xì)胞至60 mm培養(yǎng)皿中，預(yù)培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度(0、20、40、80 μmol/L)姜黃素，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集處理后的ACHN細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，向離心管中加入 100 μL的細(xì)胞裂解液超聲處理，4℃，14 000×g離心10 min；收集上清取5 μL測定其總蛋白濃度，剩余部分按照4∶1比例加入5×SDS，充分混勻，100℃煮沸5 min。配制SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，進(jìn)行凝膠電泳；電泳后，半濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入5%的脫脂奶粉，置于搖床上，室溫封閉1 h。以TBST為稀釋液配置一抗(Bcl-2、Caspase-3、GAPDH)，4℃過夜。次日用 0.1% TBST 液洗膜3次，加入相應(yīng)二抗，置于搖床上，1 h后再次洗膜3次后，鋪于曝光黑板上，將混勻的化學(xué)發(fā)光底物均勻滴在 PVDF膜上，置于曝光機(jī)中進(jìn)行曝光。觀察結(jié)果，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Real-time PCR測定ACHN細(xì)胞中Notch1基因表達(dá)量的變化 收取細(xì)胞后，用試劑盒提取RNA,并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒聚合為cDNA，以提取的細(xì)胞中cDNA位模板，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，Notch1 F:5′-CCTTTGTGCTTCTGTTCTTCG-3′,Notch1 R:5′-CCACTCATTCTGGTTGTCGTC-3′，212 bp；GAPDH F:5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，GAPDH R:5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′，532 bp。反應(yīng)在羅氏Light Cycler? 480 PCR儀上運(yùn)行，PCR反應(yīng)參數(shù): 94℃ 1 min；98℃ 10 s，60℃ 10 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃ forever。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對ACHN細(xì)胞增殖的影響 姜黃素作用后ACHN細(xì)胞增殖速度明顯降低，且抑制作用呈時間及濃度依賴性(P<0.05)，即隨著姜黃素濃度的增加，細(xì)胞增殖減慢；在相同濃度的姜黃素作用下，隨著時間延長，細(xì)胞抑制率越高。見圖1。

圖1 不同濃度姜黃素對ACHN細(xì)胞增殖的影響

2.2 姜黃素對ACHN細(xì)胞調(diào)亡的影響 隨著姜黃素濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量占比越多，即姜黃素作用后可促進(jìn)ACHN細(xì)胞的凋亡，且凋亡率呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系(P<0.01)。見圖2、表1。

表1 不同濃度姜黃素對ACHN細(xì)胞凋亡的對比

圖2 不同濃度姜黃素對ACHN細(xì)胞凋亡的影響

2.3 姜黃素對ACHN細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 隨著姜黃素濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3則表達(dá)增加，Notch 1蛋白表達(dá)增加。見圖3。

圖3 不同濃度姜黃素處理ACHN細(xì)胞24 h后相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.4 姜黃素對ACHN細(xì)胞中Notch1基因表達(dá)量的影響 不同濃度不同時間姜黃素作用后ACHN細(xì)胞中Notch1基因表達(dá)增加，且表達(dá)量呈時間及濃度依賴性(P<0.05)，即隨著姜黃素濃度的增加，Notch1基因表達(dá)增加；在相同濃度的姜黃素作用下，隨著時間延長，Notch1基因表達(dá)增加越多。見圖4。

圖4 不同濃度姜黃素對ACHN細(xì)胞Notch1基因表達(dá)的影響

3 討論

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一[6]，世界衛(wèi)生組織(WHO)下屬機(jī)構(gòu)發(fā)布的2018年全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(GLOBOCAN 2018)表明腎癌在男性和女性的惡性腫瘤中的排名分別為第6位和第10位，占2018年所有新診斷癌癥的5%和3%[7]。腎癌患者早期無明顯癥狀，大約30%的患者就診時已是轉(zhuǎn)移性腎癌。研究證實(shí)腎癌對化療、放療及激素治療等均不敏感，且治療愈后較差[8]。近年來，越來越多的研究致力于尋找治療腎癌新的有效藥物。

1985年姜黃素首次被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，并引起廣泛關(guān)注及研究[9]。姜黃產(chǎn)于東南亞，隸屬于姜科家族，具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗肝纖維化、調(diào)脂和抗動脈粥樣硬化等，且具有毒性低、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)[10]?，F(xiàn)代的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡和減少瘤體數(shù)量、減慢瘤體增長的作用，從腫瘤發(fā)展的多個環(huán)節(jié)和步驟發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[11]。

本研究利用CCK-8試劑盒檢測不同濃度姜黃素處理腎癌ACHN細(xì)胞不同時間后細(xì)胞增殖變化，結(jié)果表明姜黃素可以抑制腎癌ACHN細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈時間及濃度依賴性。利用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素可誘導(dǎo)腎癌ACHN細(xì)胞凋亡，同時凋亡率隨姜黃素濃度的增加而上升，該結(jié)果表明姜黃素可抑制腎癌ACHN細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)該細(xì)胞的凋亡，這與既往關(guān)于姜黃素對癌細(xì)胞的作用的研究[2, 12]結(jié)果相一致。

當(dāng)前，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是生命科學(xué)領(lǐng)域中的熱點(diǎn)問題。在RCC中，Notch1受體蛋白將被重新表達(dá)，以增加RCC細(xì)胞的增殖。隨著RCC的病理分級，臨床分期和腫瘤的增加，Notch1的表達(dá)水平將進(jìn)一步升高[13]。研究表明，Notch1受體在腫瘤血管中高表達(dá)，對腫瘤的增殖有一定的作用[14]。RCC中Notch1信號的異常激活，這種異常激活的Notch1信號蛋白可以通過激活PI3K-Akt和NF-κB信號通路來促進(jìn)G1-S期RCC細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程[15]。

有研究表明，腎臟透明細(xì)胞癌中Notch1和Notch信號通路的其他蛋白的陽性表達(dá)率研究表明，腎臟透明細(xì)胞癌組織中Notch1和Notch信號通路的其他蛋白的陽性表達(dá)率高于正常人[16]。腎組織，并與臨床參數(shù)如腫瘤的病理分級和大小密切相關(guān)，提示Notch1對腎癌具有重要的診斷和預(yù)后意義[17]。此外，研究表明，Notch1在腎癌細(xì)胞Caki-1和786-0中的表達(dá)明顯高于正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2，并且干擾Notch1的表達(dá)可顯著降低Caki-1細(xì)胞的生存能力，但具體的作用機(jī)制尚無報告[18]。根據(jù)張震等[19]的研究結(jié)果，Notch1在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于HK-2細(xì)胞，提示Notch1在腎癌組織中可能具有促癌作用。此外，尚春香等[20]研究表明，下調(diào)腎癌細(xì)胞Caki-1中Notch1的表達(dá)可顯著降低細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞癌組織高于正常腎組織，且與臨床參數(shù)如腫瘤的病理分級和大小密切相關(guān)，提示Notch1對腎癌的診斷和預(yù)后意義重大。本研究為探討姜黃素在促進(jìn)腎癌ACHN細(xì)胞凋亡中Notch1基因表達(dá)水平改變，Real-time PCR、Western blot檢測結(jié)果顯示Notch1基因表達(dá)增加，且表達(dá)量呈時間及濃度依賴性。

在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞凋亡是發(fā)展和維持組織穩(wěn)態(tài)的一個重要的進(jìn)化保守機(jī)制，它在癌細(xì)胞中受到干擾。細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致細(xì)胞特性的某些變化，包括活化Caspases、線粒體去極化和DNA斷裂等。

線粒體是細(xì)胞呼吸能量中心，也是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。線粒體能通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式感受來自細(xì)胞內(nèi)外的刺激，在相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)下，線粒體的膜通透性發(fā)生改變，從而釋放出相關(guān)的促凋亡因子。Bcl-2 家族蛋白就是其中最為關(guān)鍵的一種，該家族蛋白能夠形成同源二聚體或異源二聚體，通常分為兩大類：一類是抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-x)，另一類則是促凋亡蛋白(如Bax、BAK)。而抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比值關(guān)系，與細(xì)胞線粒體膜通透性的調(diào)節(jié)具有重要的相關(guān)性[21-22]。Caspase 位于細(xì)胞質(zhì)中，可選擇性切割某些蛋白質(zhì)，其中凋亡相關(guān)性 Caspase 包括凋亡效應(yīng)亞類(如Caspase-3)及凋亡啟動亞類(如Caspase-9)。凋亡過程中引發(fā) Caspase 活化的主要途徑有兩條，包括線粒體調(diào)控通路(內(nèi)源性凋亡)和細(xì)胞死亡受體介導(dǎo)通路(外源性凋亡)[23-24]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過、下調(diào) Bcl-2、上調(diào)Bax，繼而影響B(tài)cl-2與Bax的比值，激活Caspase-3的表達(dá)，從而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生[22, 25]。本研究采用Western blot檢測不同濃度姜黃素處理ACHN細(xì)胞后Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 姜黃素作用于ACHN細(xì)胞后，隨著其濃度的增加，凋亡執(zhí)行蛋白酶Caspase-3表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達(dá)減少。研究結(jié)果提示姜黃素促進(jìn)ACHN細(xì)胞凋亡可能是通過提高細(xì)胞內(nèi)Notch1基因的表達(dá)，增加Bax、Caspase-3的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白水平來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，姜黃素通過促進(jìn)ACHN細(xì)胞中Notch1基因的表達(dá)，上調(diào) Bax、下調(diào) Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而激活Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)ACHN細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此猜想Notch1基因可以促進(jìn)ACHN細(xì)胞凋亡，而其中詳細(xì)的凋亡機(jī)制還需進(jìn)一步研究。