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    狹小空間法構(gòu)建抑郁癥大鼠模型的優(yōu)劣探索*

    2021-05-26 07:48:04閆雪曾德浩李超群張毅靖祝赫唐洪梅
    廣東醫(yī)學(xué) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:動(dòng)物模型造模次數(shù)

    閆雪, 曾德浩, 李超群, 張毅靖, 祝赫, 唐洪梅

    1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部(廣東廣州 510405); 2南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院(廣東廣州 510515)

    抑郁癥是一種嚴(yán)重的精神疾病,以顯著而持久的情緒低落為主要臨床特征,給個(gè)人、家庭以及社會(huì)帶來巨大壓力和沉重的負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測抑郁癥將成為危害人類健康的第二大疾病。近年來,國內(nèi)外眾多學(xué)者對抑郁癥的基礎(chǔ)或臨床開展研究,使其成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。因此,穩(wěn)定、易于操作的抑郁癥動(dòng)物模型制備方法是這些研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。2019年,中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥實(shí)驗(yàn)藥理專業(yè)委員會(huì)起草并公布了《抑郁癥動(dòng)物模型制備規(guī)范(草案)》[1](以下簡稱“草案”)。該草案基于對現(xiàn)有抑郁癥動(dòng)物模型大量實(shí)驗(yàn)研究,總結(jié)了6類抑郁模型,其中有藥物、手術(shù)和慢性不可預(yù)知應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)等多種不同的方式。慢性不可預(yù)知應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)模型是近年來廣受關(guān)注的一種抑郁癥研究模型,其疾病發(fā)生和表現(xiàn)形式更符合人類的發(fā)病原因,可模擬人類的抑郁癥狀及一系列抑郁后生物化學(xué)改變,已被廣泛應(yīng)用于抑郁癥研究領(lǐng)域[2]。但該方法存在耗時(shí)較長,勞動(dòng)量大,結(jié)果不穩(wěn)定,難重復(fù)的問題。特別是造模的強(qiáng)度和時(shí)間難以掌握,實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物如所受刺激過于強(qiáng)烈,動(dòng)物會(huì)對應(yīng)激產(chǎn)生耐受或者動(dòng)物變得異常狂躁;如所受刺激過于溫和,動(dòng)物則不易產(chǎn)生抑郁樣行為[1]。本研究自2019年7月至2020年4月,模擬抑郁癥發(fā)病的刺激因素,創(chuàng)新性地嘗試一種新的造模方式,亟待能通過容易操作的刺激方式構(gòu)建耗時(shí)短、勞動(dòng)量小、易控制刺激強(qiáng)度的抑郁癥大鼠模型,且有與經(jīng)典方法相同的造模效果。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SPF級SD雄性大鼠30只,體重(250±20)g,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCK(粵)2013-0034。水合氯醛(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,20190901),4%多聚甲醛(上海生工,E672002)、RIPA蛋白裂解液(廣州杏海生物,GB20173)、HE染色相關(guān)試劑(珠海貝索,EA-50)、冰凍切片機(jī)(leica,CM1950)、ELISA試劑盒[5-羥色胺(5-HT)](南京建成,H104),自制曠場反應(yīng)箱。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物分組與造模方法 將大鼠30只常規(guī)飼養(yǎng)1周,后隨機(jī)分為3組,正常對照組、慢性溫和不預(yù)知應(yīng)激模型組(CUMS組)和狹小空間模型組(M組)10只。正常對照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。CUMS組采用應(yīng)激方式如下:禁食24 h/次、禁水24 h/次、鼠籠傾斜30°過夜/次、潮濕飼養(yǎng)過夜/次、4℃冰水游泳5 min/次、晝夜顛倒/次、夾尾1 min/次,采用隨機(jī)數(shù)字表法每天隨機(jī)予2種應(yīng)激。造模4周。M組大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于10 cm×10 cm×5 cm的狹小孤籠中,給予正常飲食,連續(xù)造模4周。

    1.2.2 體重測定 各組大鼠在0、7、14、21、28 d測量體重。

    1.2.3 飲水及攝食量測定 各組大鼠在0、7、14、21、28 d測量飲水及攝食量。測定前于0 h稱量并記錄水瓶及飼料的重量,24 h內(nèi)大鼠自由飲水進(jìn)食,24 h后再次稱量并記錄水瓶及飼料的重量,計(jì)算飲水及飼料的消耗量。

    1.2.4 糖水偏好試驗(yàn) 各組大鼠在0、7、14、21、28 d進(jìn)行1次此試驗(yàn)。試驗(yàn)前禁食、禁水12 h,試驗(yàn)時(shí),首先將各組大鼠孤籠飼養(yǎng),然后每籠放置2個(gè)裝有2%蔗糖水的小瓶,12 h后換為每籠2%蔗糖水和飲用水各1瓶,2 h后取走所有小瓶并稱重,計(jì)算糖水、飲用水和總液體消耗量以及糖水偏愛百分比。

    1.2.5 曠場試驗(yàn) 大鼠曠場反應(yīng)箱100 cm×100 cm×35 cm,內(nèi)壁涂黑,底面平均分為25個(gè)20 cm×20 cm小方格,曠場正上方2 m處架一數(shù)碼攝像頭,其視野覆蓋整個(gè)曠場。試驗(yàn)時(shí)將大鼠放置于清潔敞箱中央,每次錄像時(shí)間5 min,然后人工計(jì)算大鼠直立次數(shù)和穿格次數(shù),各組大鼠在0、14、28 d各試驗(yàn)1次。

    1.2.6 HE染色檢測 用水合氯醛麻醉大鼠,4%多聚甲醛全身灌注,取海馬組織使用酒精梯度脫水、石蠟包埋和冰凍切片。將制好的切片脫蠟至水,逐步完成染色、脫水、透明、封固后,進(jìn)行鏡下觀察。

    1.2.7 ELISA法檢測海馬組織5-HT含量 海馬組織使用RIPA蛋白裂解液勻漿提取蛋白備用,按照ELISA試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作檢測。

    1.3 指標(biāo)分類及量化評分[1]

    1.3.1 表觀指標(biāo) Ⅰ類指標(biāo)(核心指標(biāo)):動(dòng)物的體重、偏好、活動(dòng)性、食欲等是該模型重要的表觀指標(biāo)。模型制備成功后,體重減輕、興趣索然、活動(dòng)性顯著降低、食欲下降。表觀指標(biāo)在抑郁癥模型的評價(jià)中占有重要地位,根據(jù)表觀指標(biāo)的特點(diǎn)評分,正常得0分,異常得1分。

    1.3.2 生化指標(biāo) Ⅱ類指標(biāo)(直接相關(guān)指標(biāo)):目前,抑郁癥的病因并不清楚,發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,多數(shù)學(xué)者將其歸因于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說,其認(rèn)為5-HT的含量降低是抑郁癥的重要生化指標(biāo)。5-HT含量正常得0分,異常得1分。

    1.3.3 病理學(xué)指標(biāo) Ⅲ類指標(biāo)(間接相關(guān)指標(biāo))病理學(xué)指標(biāo)不是臨床診斷的內(nèi)容,主要是模型研究時(shí)體現(xiàn)。對腦組織的組織形態(tài)的變化是抑郁癥模型組織病理變化研究的重點(diǎn)。腦組織的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目正常,形態(tài)整齊,包漿豐富,排列規(guī)律整齊得0分;神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少,形態(tài)不整齊,包漿固縮,排列無規(guī)律、較紊亂得1分。

    1.3.4 指標(biāo)分類及量化評分 將以上指標(biāo)進(jìn)行分類,并確定各類權(quán)重系數(shù)。草案對表觀指標(biāo)中的7項(xiàng)小指標(biāo)進(jìn)行了評分,而本研究僅對其中5項(xiàng)進(jìn)行評分,因此Ⅰ類指標(biāo)權(quán)重系數(shù)僅為原草案表觀指標(biāo)評分權(quán)重系數(shù)的5/7為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。見表1。

    表1 指標(biāo)分級

    2 結(jié)果

    2.1 體重變化 0、7 d 3組大鼠的體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);14 d,CUMS組、M組大鼠的體重與正常對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且CUMS組與M組大鼠的體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);21 d CUMS組、M組大鼠與正常對照組相比體重差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);28 d CUMS組、M組大鼠與正常對照組相比體重差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);21 d、28 d CUMS組與M組大鼠的體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    表2 大鼠體重情況

    2.2 狹小空間模型大鼠飲水及進(jìn)食量變化 兩組大鼠在0 d的飲水和進(jìn)食量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但在造模7 d時(shí),M組大鼠的飲水量明顯減少,與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),CUMS組雖然飲水量減少,但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);造模7 d時(shí),CUMS組、M組與正常對照組比較進(jìn)食量減少并差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。14、21、28 d,CUMS組、M組與正常對照組比較飲水量及進(jìn)食量均減少并差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。見表3~4。

    表3 大鼠飲水量情況

    2.3 狹小空間模型大鼠糖水偏好度變化 0、7 d 3組大鼠的糖水偏好百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);14 d M組大鼠的糖水偏好百分比與正常對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);21、28 d CUMS組、M組大鼠與正常對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);0、7、14、21、28 d CUMS組與M組大鼠的糖水偏好百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

    表4 大鼠進(jìn)食量情況

    表5 造模不同時(shí)間糖水偏好百分比

    2.4 曠場實(shí)驗(yàn) 0 d 3組大鼠的直立次數(shù)與方格間穿越次數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。7 d CUMS組與正常對照組相比直立次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),方格間穿越次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);M組與正常對照組相比直立次數(shù)和方格間穿越次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),M組與CUMS組相比直立次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),方格間穿越次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。14、21、28 d,CUMS組、M組大鼠與正常對照組相比,直立次數(shù)與方格間穿越次數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。14、21 d, CUMS組與M組大鼠相比直立次數(shù)與方格間穿越次數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);28 d, CUMS組與M組大鼠相比直立次數(shù)及方格間穿越次數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。見表6~7。

    表6 曠場實(shí)驗(yàn)中大鼠直立次數(shù) 次

    表7 曠場實(shí)驗(yàn)中大鼠方格間穿越次數(shù) 次

    2.5 狹小空間模型大鼠海馬組織病理變化 正常對照組大鼠海馬組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,排列整齊,形態(tài)完整。CUMS組及M組大鼠海馬組織呈現(xiàn)彌散性損傷,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目較少,形態(tài)不整齊,包漿固縮,排列無規(guī)律、較紊亂。見圖1。

    注:A:正常對照組;B CUMS組;C:M組

    2.6 狹小空間模型大鼠血清中5-HT含量變化 正常對照組、CUMS組和M組的5-HT水平分別是983.21±54.18、353.67±25.33和365.23±23.54。與正常對照組比較,CUMS組及M組大鼠海馬組織5-HT水平顯著降低(P<0.01),且CUMS組與M組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.7 模型制備評判標(biāo)準(zhǔn) CUMS組與M組抑郁癥模型得總積分>0.5,提示模型制備成功。見表8。

    表8 各組模型的量化評分 分

    3 討論

    全世界約有3.5億人飽受抑郁之苦,中國的抑郁癥發(fā)病率約為3.02%,據(jù)估計(jì)真實(shí)的數(shù)據(jù)可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這個(gè)數(shù)字[3]。然而,目前人類對于抑郁癥的病因和發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。其機(jī)制的研究和藥物的研發(fā)必須首先建立在比較理想的抑郁癥動(dòng)物模型上。目前已經(jīng)用于構(gòu)建的抑郁癥大鼠模型的大鼠主要有天生對應(yīng)急敏感的WISTAR KYOTO(WKY)大鼠[4]、具有遺傳抑郁基因的Flinder Resistant Line(FSL)大鼠[5]、Sprague dawley(SD)大鼠[6]、天生嗜酒的Fawn Hooded(FH)大鼠[7]和腦內(nèi)5-HT活力低下的Tryon Maze Dull(TMD)大鼠等;每種大鼠模型均具有自己的優(yōu)缺點(diǎn)[2]。然而目前還并沒有一個(gè)動(dòng)物模型能夠完全涵蓋所有的抑郁癥狀。因此,可以聯(lián)用多種造模方法以建立較為全面、與人類抑郁癥狀更為相似的動(dòng)物模型,從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

    一個(gè)理想的抑郁癥動(dòng)物模型應(yīng)該具有良好的表觀信度、內(nèi)在信度和預(yù)測信度;也就是動(dòng)物行為特點(diǎn)和人抑郁癥癥狀相似,動(dòng)物模型的病理生理機(jī)制與人類相同,人類有效抗抑郁藥物對動(dòng)物有效[8]。目前抑郁癥動(dòng)物模型的觀測指標(biāo)[1]主要包括:表觀指標(biāo)、生化指標(biāo)、病理學(xué)指標(biāo)。表觀指標(biāo)為Ⅰ類指標(biāo)(核心指標(biāo)),模型制備成功后,動(dòng)物有食欲下降、體重減輕、活動(dòng)性顯著降低等表現(xiàn)。抑郁癥的病因并不清楚,發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,多數(shù)學(xué)者將其歸因于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說,因此認(rèn)為5-HT失常是抑郁癥的生化基礎(chǔ)之一。臨床診斷不使用病理學(xué)指標(biāo)作為抑郁癥診斷的指標(biāo),該指標(biāo)主要用于對動(dòng)物模型的研究中。

    抑郁癥動(dòng)物模型制備規(guī)范草案提示,研究者應(yīng)根據(jù)各類指標(biāo)對抑郁癥模型的貢獻(xiàn)不同進(jìn)行分級,盡量將單純的定性描述轉(zhuǎn)變成可量化或半量化的指標(biāo),提高判定的可控性。抑郁癥模型每次造??赡軙?huì)出現(xiàn)不同的總積分,總積分可以有20%左右的偏差,所得總積分應(yīng)>0.5,則可認(rèn)為該模型制備成功。本研究參考了草案所采用的計(jì)算方法及三類指標(biāo)的權(quán)重分值,同時(shí)也按草案建議根據(jù)不同制備模型方法及所觀測指標(biāo)的不同對計(jì)算方法進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整。

    本研究分別從生理及行為學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)、病理學(xué)指標(biāo)這3個(gè)方面驗(yàn)證狹小空間大鼠抑郁癥模型。與正常對照組相比,M組的表觀指標(biāo)包括體重、飲水量、進(jìn)食量、糖水偏好度、活動(dòng)行為均明顯降低,海馬組織中5-HT的含量顯著下降,且組織呈現(xiàn)彌散性損傷,在這三方面均達(dá)到了造模的要求。而本模型造模僅需要將體重在規(guī)定區(qū)間范圍內(nèi)的大鼠飼養(yǎng)在孤立與狹小的鼠籠中,使其雖能正常飲水進(jìn)食但行為上的自由活動(dòng)受限,操作簡便,不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡或過于煩躁攻擊實(shí)驗(yàn)人員。相較于經(jīng)典的慢性CUMS[9],本造模方法的優(yōu)點(diǎn)在于:便于操作,重復(fù)性強(qiáng),不損失實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。慢性不可預(yù)見應(yīng)激模型可模擬生活中遇到的各種刺激因素,造成動(dòng)物心理上的抑郁。CUMS模型刺激方法[10]包括:禁水、禁食、夾尾、冰水游泳、鼠籠傾斜、日夜顛倒等不下10種,3~4周內(nèi)每天隨機(jī)給予1種刺激,使動(dòng)物無法預(yù)料給予何種刺激從而避免適應(yīng)。此種模型制備方法復(fù)雜多樣,操作相對繁瑣,重復(fù)性差,工作量大[11],時(shí)間成本高,重復(fù)性、可靠性差[12]。刺激方法中的冰水游泳易使動(dòng)物因低溫死亡,夾尾刺激易使動(dòng)物過于煩躁攻擊實(shí)驗(yàn)人員。CUMS模型可以根據(jù)研究目標(biāo)藥物的可能作用機(jī)制、藥物起效快慢或療程來確定CUMS周期和適宜的給藥時(shí)間。也因此,CUMS模型存在幾方面問題:應(yīng)激項(xiàng)目沒有公認(rèn)的選擇方案,應(yīng)激的操作順序沒有統(tǒng)一規(guī)范,各應(yīng)激的刺激強(qiáng)度沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),各應(yīng)激操作時(shí)間安排未作詳細(xì)敘述等,認(rèn)為,未來CUMS模型的發(fā)展需要將上述幾方面考慮在內(nèi),更嚴(yán)格規(guī)范CUMS操作規(guī)程,是保證模型穩(wěn)定性和可復(fù)制性的重要前[13]。

    總之,本研究采用狹小空間方法成功構(gòu)建抑郁癥大鼠模型(M),并且本模型能夠縮短抑郁癥模型的成模時(shí)間。方法簡便、穩(wěn)定、省時(shí)和造模效果好,為抑郁癥模型大鼠模型的構(gòu)建提供一種安全有效的新方法。

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