MR定量磁敏感圖評(píng)估大鼠肩胛區(qū)棕色脂肪代謝活性的價(jià)值*

祝翠玲, 郭義昊, 鐘俏玲, 斯文彬, 蔡子萌, 余琴琴, 余可妍, 馮衍秋, 張曉東△

1南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院、廣東省骨科研究院影像科(廣東廣州 510630)； 南方醫(yī)科大學(xué) 2生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(廣東廣州 510515)

肥胖是一項(xiàng)重大的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，過(guò)度肥胖將導(dǎo)致糖尿病、血管性疾病、心臟功能障礙或其他代謝相關(guān)性疾病[1-2]。棕色脂肪(brown adipose tissue， BAT)在肥胖癥的病因和治療中起作用，因?yàn)槠渚€粒體中存在特異性的解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein1，UCP1)，能將呼吸鏈與ATP合成解偶聯(lián)，消耗脂質(zhì)或葡萄糖釋放熱量，從而改善糖、脂代謝，預(yù)防肥胖的發(fā)生，因此準(zhǔn)確檢測(cè)及定量分析未激活與激活狀態(tài)的BAT對(duì)治療肥胖等代謝性疾病具有重要意義。通過(guò)暴露于寒冷環(huán)境中來(lái)刺激嚙齒類(lèi)動(dòng)物肩胛區(qū)的BAT促進(jìn)非顫抖性產(chǎn)熱反應(yīng)被認(rèn)為是降低三酰甘油和對(duì)抗肥胖的一種手段[3]，同時(shí)冷刺激也是激活BAT最簡(jiǎn)便的一種方法。由于BAT激活后細(xì)胞和組織水平會(huì)發(fā)生一些改變，包括富含鐵的線粒體含量增加、血液灌注的增加以及脂質(zhì)的減少[4]， 因此可利用這些特性對(duì)BAT進(jìn)行定量分析，脂肪分?jǐn)?shù)(fat fraction，F(xiàn)F)和R2*(1/T2*)最常應(yīng)用于脂肪的定量分析。這些定量指標(biāo)雖然應(yīng)用廣泛，但仍存在許多不足，尋找一種準(zhǔn)確有效且能反映BAT代謝活性的方法至關(guān)重要。定量磁敏感圖(QSM)可定量檢測(cè)組織磁化率的變化，QSM計(jì)算所得的磁化率數(shù)值能反應(yīng)組織在磁場(chǎng)中被磁化的程度，且對(duì)組織鐵含量變化比較敏感[5-7]。但目前使用QSM來(lái)定量檢測(cè)BAT的代謝活性鮮有報(bào)道。2019年3—12月，本研究基于BAT代謝活性的變化可引起QSM值的改變，初步探討QSM值定量評(píng)估活體大鼠BAT代謝活性的可行性，為肥胖及其代謝相關(guān)性疾病的診療提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性，6周齡，體重200～250 g)，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用獲得南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 冷刺激組與對(duì)照組 待大鼠適應(yīng)環(huán)境1周(自由飲水飲食，動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度(23±2)℃，晝夜節(jié)律為12 h/12 h)后，按照隨機(jī)原則將大鼠隨機(jī)分為冷刺激組和對(duì)照組。冷刺激組：5只SD大鼠獨(dú)立裝入鼠籠內(nèi)，暴露于低溫實(shí)驗(yàn)冷柜中(海爾，中國(guó))，冷柜內(nèi)溫度4℃，暴露12 h。另外5只對(duì)照組大鼠在動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。在冷暴露過(guò)程中，所有大鼠禁食、禁水。

1.3 磁共振掃描 采用7.0T Bruker小動(dòng)物磁共振成像設(shè)備，使用具有以下參數(shù)的4通道頭線圈的三維多回波梯度回波序列：TR=50 ms；TE1/ΔTE/#TE=1.7 ms/1.3 ms/10；矩陣大小=[90×90×60]；體素大小=[0.4 mm×0.4 mm×0.4 mm]，翻轉(zhuǎn)角度=[20°]。采用呼吸門(mén)控并使用同相回波(第2、第5、第8回波)計(jì)算初始R2*圖和場(chǎng)圖。然后利用R2*-IDEAL序列所得到的R2*圖和場(chǎng)圖初始化，利用所有的回波得到水圖、脂肪圖、R2*圖和場(chǎng)圖。QSM重建使用Matlab軟件包對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行后處理，首先對(duì)場(chǎng)圖解纏繞,然后利用去除背景場(chǎng)和偶極子反演技術(shù)，由最終的場(chǎng)圖計(jì)算得到。

1.4 勾選感興趣區(qū)(ROIs) 采用ITK-SNAP軟件選取3D ROIs，BAT的ROIs是在大鼠肩胛區(qū)的FF圖上手動(dòng)繪制的，避開(kāi)周?chē)难?，從最大層面開(kāi)始依次勾畫(huà)3層，然后將其應(yīng)用在QSM圖、R2*圖中。計(jì)算出定義在ROIs內(nèi)QSM值(ppb)和R2*值(s-1)的平均值。

1.5 組織取材及處理 MRI掃描結(jié)束后，立即采用頸椎脫位法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將每只小鼠背側(cè)朝上，用剪刀從背側(cè)向頸部剪開(kāi)，小心地提起皮膚，向左右前肢各開(kāi)1個(gè)切口，仔細(xì)的切開(kāi)皮膚并分離出BAT；一部分組織立即冷凍在液氮中，隨即轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?；一部分組織用4%多聚甲醛(PFA)在4℃固定24 h，石蠟包埋樣本后續(xù)制備病理切片。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠BAT UCP-1蛋白的表達(dá) 從-4℃冰箱中取出切片，室溫放置1 h，放入烤箱(65℃)中烤片1 h，然后進(jìn)行脫蠟水化，PBS清洗3次；將切片置于已經(jīng)煮沸的枸櫞酸鈉中高火過(guò)夜，修復(fù)抗原，PBS洗滌，使用免疫組化筆畫(huà)圈防止液體外溢；滴加3%的過(guò)氧化氫避光封閉，PBS洗滌3次； 5%(v/v)山羊血清室溫封閉30 min；甩掉玻片上殘余的液體，滴加稀釋的一抗(兔抗鼠UCP-1)孵育，4℃過(guò)夜；次日除去玻片上的一抗液體，使用PBS清洗，滴加羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h；PBS洗3次，滴加辣根酶標(biāo)記的工作液孵育15 min，使用PBS洗3次；弱光下進(jìn)行室溫DAB顯色，使用顯微鏡來(lái)控制顯色程度，純水輕輕沖洗，用蘇木素復(fù)染然后在分化液中返藍(lán)；使用不同濃度梯度的乙醇進(jìn)行脫水，然后二甲苯透明和中性樹(shù)膠封片。采用Image Pro Plus6.0軟件在400倍圖片上隨意選擇5個(gè)區(qū)域測(cè)量光密度(IOD)，然后取平均值，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.3軟件，首先對(duì)冷刺激組(n=5)與對(duì)照組(n=5)的QSM值、R2*值和UCP-1半定量值分別進(jìn)行檢驗(yàn)以驗(yàn)證數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，再進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)表現(xiàn) 對(duì)照組與冷刺激組的FF圖、QSM圖、R2*圖分別見(jiàn)圖1、2，F(xiàn)F圖中紅箭頭及QSM圖中藍(lán)色輪廓顯示大鼠肩胛區(qū)BAT，R2*圖顯示BAT輪廓不如QSM圖。在FF圖及R2*圖中，冷刺激組相對(duì)于對(duì)照組的BAT信號(hào)暗一些。在QSM偽彩圖中，可以看到對(duì)照組BAT為黃色，冷刺激組BAT為青色，提示QSM值的降低，這與我們定量測(cè)量的結(jié)果一致。

圖1 對(duì)照組的FF圖、QSM圖及R2*圖

圖2 冷刺激組的FF圖、QSM圖及R2*圖

2.2 不同組間磁共振參數(shù)數(shù)值比較 冷刺激組的R2*值、QSM值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 不同組間各參數(shù)測(cè)量結(jié)果比較

2.3 免疫組化染色結(jié)果 冷刺激組可見(jiàn)大量陽(yáng)性表達(dá)顆粒，對(duì)照組可見(jiàn)弱陽(yáng)性，見(jiàn)圖3。UCP-1在對(duì)照組和冷刺激條件下均可見(jiàn)到高密度的胞質(zhì)染色，部分由于冷刺激的BAT中脂質(zhì)含量明顯降低，使總胞質(zhì)UCP-1含量有所升高所致。對(duì)照組的UCP-1半定量值為478.46±446.14，冷刺激組為1 762.15±1 005.74，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 兩組的UCP-1免疫組織化學(xué)染色圖(×200)

3 討論

QSM能夠較準(zhǔn)確、真實(shí)地反映組織磁化率的空間分布情況，已經(jīng)很好地應(yīng)用于量化大腦和肝臟內(nèi)的鐵沉積[8-10]、鑒別鈣化和出血[11]以及評(píng)估脊柱的骨質(zhì)疏松[12]。QSM值的變化受順磁性物質(zhì)鐵的積累、順磁離子氧化態(tài)和抗磁性物質(zhì)的共同影響。在本項(xiàng)研究中，我們根據(jù)MR定量參數(shù)(QSM值、R2*值)的差異區(qū)分BAT的代謝狀態(tài)，并結(jié)合組織學(xué)分析來(lái)評(píng)估QSM作為這些過(guò)程的潛在生物標(biāo)記的可能性。

BAT的數(shù)量增多或活性增加是治療肥胖、糖尿病等代謝性疾病的關(guān)鍵因素。然而，BAT在人體內(nèi)數(shù)量有限且分散，因此BAT代謝活性的測(cè)定至關(guān)重要。BAT中存在大量富含鐵的線粒體，鐵是人體內(nèi)非常重要的一種微量元素，在機(jī)體的氧氣運(yùn)輸和細(xì)胞的有氧代謝過(guò)程發(fā)揮著巨大作用，鐵亦是構(gòu)成電子傳遞鏈的線粒體內(nèi)膜復(fù)合物的基本成分，因此在能量代謝中是必需的。已知將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于低溫環(huán)境中將導(dǎo)致BAT的細(xì)胞和組織發(fā)生改變，激活后的BAT代謝活性增加，脂肪含量降低、線粒體內(nèi)鐵含量及耗氧量增加(脫氧血紅蛋白)[13-15]，因此先前很多研究者利用這些生理特性，多采用通過(guò)測(cè)量FF和R2*(1/T2*)的方法來(lái)定量BAT，但由于肩胛區(qū)BAT和白色脂肪常常混合存在，F(xiàn)F體現(xiàn)的可能是兩者混合的脂肪區(qū)域的總體脂肪分?jǐn)?shù)，且相對(duì)脂肪細(xì)胞本身的大小MR所用體素大的原因，僅用BAT的FF作為絕對(duì)或者單一評(píng)估BAT代謝活性的指標(biāo)是不準(zhǔn)確的；另一種磁共振參數(shù)是R2*，該參數(shù)對(duì)鐵的存在也很敏感，然而在磁化率差異較大的組織界面(如空氣與軟組織、顱底骨氣交界處)以及一些微觀結(jié)構(gòu)的檢測(cè)時(shí)，R2*受影響較大，R2*亦與磁場(chǎng)強(qiáng)度有關(guān)，在高場(chǎng)強(qiáng)下信號(hào)衰減快，因此會(huì)導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)確。有學(xué)者[16]利用R2*對(duì)人體鎖骨上區(qū)域BAT的代謝活性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)R2*不僅受到線粒體中鐵的影響，而且還受到組織灌注變化的影響，R2*值在這個(gè)過(guò)程中是動(dòng)態(tài)變化的[17]，而且可重復(fù)性差，因此R2*的測(cè)量可能不足以準(zhǔn)確地可靠地量化BAT的代謝活性。

在這項(xiàng)研究中，我們采用單次3D多回波梯度回波序列(mGRE)提取定量參數(shù)圖R2*并利用去除背景場(chǎng)和偶極子反演技術(shù)，從B0場(chǎng)計(jì)算出QSM，大大縮短了掃描時(shí)間并減少由此產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)偽影。我們?cè)贐AT是否接受冷刺激的狀態(tài)下，使用QSM來(lái)對(duì)其進(jìn)行測(cè)量和量化，為了激活BAT，我們將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物暴露在4℃寒冷環(huán)境下12 h。本組資料結(jié)果顯示，在冷刺激條件下，BAT的QSM值、R2*值均低于對(duì)照組，與Ghassaban等[18]的研究中鐵含量的增加導(dǎo)致QSM值增加不一致，可能因?yàn)樵谶@個(gè)過(guò)程中鐵的變化不明顯而脂肪含量變化顯著。已有研究表明，冷刺激后的BAT脂肪含量較低，水分含量相對(duì)較高[19-20]，而脂肪作為一種額外的化學(xué)物質(zhì)相對(duì)于水來(lái)說(shuō)具有順磁性[21]而影響對(duì)組織磁化率的精確估計(jì)。本研究中冷刺激組由于脂肪含量明顯降低導(dǎo)致順磁性物質(zhì)減少，而線粒體中順磁性的鐵含量增加不足以補(bǔ)償脂肪減少所產(chǎn)生的效應(yīng)，因此QSM值、R2*值較對(duì)照組減?。涣硪环矫嫖覀儫o(wú)法保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在MR掃描期間繼續(xù)暴露在低溫下，溫度的變化可能會(huì)影響B(tài)AT血流動(dòng)力學(xué)的改變，使組織的磁化率發(fā)生變化，尚需要進(jìn)一步深入研究。

此外，本研究的免疫組化UCP-1半定量分析結(jié)果顯示，冷刺激組UCP1蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加，與以往文獻(xiàn)[13，22]結(jié)果一致，說(shuō)明UCP-1的含量與其代謝活性關(guān)系密切；兩組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果有差異，但差異不夠顯著提示本研究中BAT可能尚未完全激活，且在MR掃描過(guò)程中沒(méi)有對(duì)環(huán)境溫度加以控制。然而，不管BAT有沒(méi)有接受冷刺激均表達(dá)UCP1蛋白，因此我們使用免疫組化染色對(duì)該蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果兩組均可見(jiàn)到胞質(zhì)陽(yáng)性染色顆粒，證明我們?cè)u(píng)估的是真正的BAT。我們認(rèn)為UCP-1蛋白水平在不同冷刺激方案的變化與BAT的激活狀態(tài)有關(guān)，在未來(lái)的研究中，可以設(shè)計(jì)慢性間歇冷刺激[23]對(duì)暴露在較長(zhǎng)時(shí)間的寒冷環(huán)境中的多參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)量以求得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

在我們的研究中可以看到QSM圖顯示BAT的區(qū)域較R2*圖清晰，QSM值的組間差異性比較也較R2*值大，QSM受微觀磁化率分布的影響較小，對(duì)脂肪和鐵含量的變化比較敏感，克服了磁場(chǎng)分布的不均勻性并提供定量和局部解剖學(xué)對(duì)比，在評(píng)估BAT的代謝活性方面較R2*優(yōu)越。以往多個(gè)研究亦表明QSM比R2*定量分析鐵更可靠[6，24]。

本研究存在一些局限性：(1)本次數(shù)據(jù)的樣本量，可能會(huì)影響統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的強(qiáng)度和對(duì)結(jié)果的合理解釋。因此，結(jié)果仍需要更大的樣本量來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)；(2)ROI放置位置及大小、形態(tài)的選擇可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定影響；(3)急性冷刺激激活BAT可能不如間歇性冷刺激有效，利用間歇性冷刺激可能有助于區(qū)分鐵對(duì)磁化率的貢獻(xiàn)；(4)沒(méi)有測(cè)量組織中鐵的含量，不能從生理學(xué)角度對(duì)BAT進(jìn)一步分析；(5)本研究?jī)H限于組間比較，并未探究縱向動(dòng)物活體成像潛能，未來(lái)的研究將集中于縱向測(cè)量單個(gè)動(dòng)物活體成像變化的能力，并做好重復(fù)性驗(yàn)證。

綜上所述，利用單個(gè)三維多回波梯度回波序列得到QSM來(lái)評(píng)估不同代謝狀態(tài)下的BAT代謝活性是可行的，提示QSM值可以作為一個(gè)非常有潛力的研究BAT的生物學(xué)標(biāo)記。QSM不僅能夠?qū)AT進(jìn)行定量，還能夠識(shí)別在R2*圖上部分不明顯的BAT區(qū)域的輪廓。因此，可以預(yù)期QSM有可能作為一種新的非侵入性工具來(lái)評(píng)估伴隨著代謝活性改變的BAT。