臍帶血造血干細胞-196 ℃保存20年后質(zhì)量分析

雒 猛，王 忠，高 峰，王 凱，趙清剛

山東省臍帶血造血干細胞庫，山東濟南 250102

臍帶血干細胞的應用，已從當初的移植治療血液病逐步向治療多種疾病方向發(fā)展，臍帶血來源的干細胞對治療早產(chǎn)兒腦損傷和神經(jīng)后遺癥、失代償期酒精性肝硬化、自身免疫性疾病、黏多糖病和1型糖尿病等均有很好的療效[1-8]。臍帶血自采集到應用有相當一段時間的間隔，把獲得的干細胞儲存于液氮中，是目前通用的方式。干細胞在液氮中可以保存幾個月至十多年仍有很高的細胞活性[9-13]。本研究對-196 ℃儲存的20年臍帶血200份進行檢測，并進行質(zhì)量分析。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 設備：流式細胞儀(美國BD calibur)、全自動血液分析儀(日本希森美康XN-350)、液氮罐(美國THERMO)、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國THERMO)、BacT/ALERT 3D 240全自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)(法國梅里埃)、全自動酶免分析儀(奧斯邦STAR+FAME)。試劑：美國BD公司生產(chǎn)的CD34、CD45、mouse IgG、甲基纖維素(加拿大Stemcell)、臺盼藍(德國Sigma)、培養(yǎng)瓶 BacT/ALERT的需氧瓶和厭氧瓶(法國梅里埃)。

1.2標本處理 選取2000年儲存已滿20年的血液200例，入庫前傳染病等各項檢測指標符合入庫標準，標本一直凍存于液氮中。從液氮罐中取出標本，在37 ℃水浴中迅速2 min內(nèi)復融，標本進行后續(xù)檢測。

1.3傳染病檢測 -20 ℃保存標本，取出當時保留的母血、臍帶血復檢標本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，采用全自動酶免分析系統(tǒng)分別檢測母血、臍帶血血漿的乙肝表面抗原(HBsAg)、丙肝病毒抗體(抗-HCV)、梅毒螺旋體抗體(抗-TP)、人類免疫缺陷病毒抗體(抗-HIV)(1+2)和巨細胞病毒(CMV)-IgM抗體。

1.4有核細胞數(shù)(TNC) 復蘇后的臍帶血標本采用全自動血液分析儀獲取TNC。TNC的平均回收率為復蘇后的TNC均值/凍存前TNC均值×100%。

1.5細胞活力檢測 采用臺盼藍拒染法檢測細胞的活性，取50 μL臍帶血標本與等體積的臺盼藍溶液混勻后，立即取混合懸液鏡檢，計算其細胞活性。

1.6粒-單核細胞集落形成單位(CFU-GM) 采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)液，以細胞濃度為5×105/mL吸取20 μL接種于48孔培養(yǎng)板中，每份標本設置3孔，培養(yǎng)板放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14 d后倒置顯微鏡觀察，以大于40個細胞組成的細胞團確認為一個集落，3孔取均值為標本的集落數(shù)。

1.7CD34+數(shù)值計算 標記流式進樣管，設置同型對照，陰性管加入20 μL的CD45-FITC和Mouse-IgG1-PE，陽性管加入20 μL的CD45-FITC、CD34-PE，在陰、陽管中分別加入100 μL標本，室溫避光孵育15 min后，加入溶血素室溫反應10 min，以2 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入500 μL PBS重懸，上機檢測。根據(jù)流式細胞儀圈門法計算CD34+比值(CD34數(shù)目與CD45數(shù)目比值)，利用TNC與CD34+比值相乘，計算獲得CD34+數(shù)值。

1.8細菌/真菌培養(yǎng) 采用全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)對復蘇的臍帶血標本分別進行需氧/真菌和厭氧菌培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為5 d。

2 結(jié) 果

2.1傳染病檢測結(jié)果 按照臍帶血造血干細胞庫技術規(guī)范要求(試行)，對入庫臍帶血對應的母血進行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP和CMV-IgM抗體檢測，200份標本母血傳染病結(jié)果均無反應性。同時按照規(guī)范和本庫的要求，出庫的標本需要同時進行母血、臍帶血的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP和CMV-IgM抗體檢測，檢測結(jié)果均為無反應性。200份復蘇后臍帶血分別接種于需氧/真菌、厭氧培養(yǎng)瓶中進行5 d的培養(yǎng)，結(jié)果均和入庫的檢測結(jié)果一致，臍帶血無菌生長。見表1。

表1 凍存前與復蘇后母血、臍帶血傳染病及微生物檢測結(jié)果

2.2TNC 入庫前檢測200份臍帶血的TNC為(11.2±4.8)×108，凍存20年復蘇后的TNC為(10.1±4.0)×108，TNC的平均回收率為90.18%，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；入庫前檢測200份臍帶血的活性為(99.5±1.3)%，復蘇后臍帶血的活性為(75.4±2.4)%，細胞活性比率為75.78%，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；入庫前檢測200份臍帶血的CFU-GM為(1.9±0.8)×106，復蘇后的CFU-GM為(1.4±0.6)×106，CFU-GM的比率為73.68%，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；入庫前檢測200份臍帶血的CD34+為(3.1±2.3)×106，復蘇后的CD34+為(2.4±2.1)×106，CD34+的比率為77.42%，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液，過去是作為醫(yī)療廢物來處理。臍帶血移植已經(jīng)成為繼骨髓移植和外周血干細胞移植后的一種重要的造血干細胞來源。臍帶血干細胞資源豐富，可變廢為寶，對供者(母嬰)無任何不良影響，病毒感染風險低，人類白細胞抗原組織配型相合要求低，移植后發(fā)生排斥反應的危險性小，移植物抗宿主病反應低，干細胞不受疾病、衰老等影響，臍帶血干細胞在血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病治療方面越來越受到重視[13]。

臍帶血自儲存到應用會有一段時間的液氮凍存，因條件限制，在移植使用前不可能獲得該份臍帶血現(xiàn)實、真實的數(shù)據(jù)，臨床醫(yī)生選用臍帶血的參考依據(jù)為凍存前的檢測數(shù)據(jù)，臍帶血是否有傳染病？是否有微生物污染？經(jīng)凍存后的臍帶血質(zhì)量指標是否會下降？隨著凍存年限的增加，細胞質(zhì)量是否會逐年降低？這些都是臨床醫(yī)生所關心的問題。

本研究對當初的檢測標本進行了傳染病指標檢測，因新生兒出生前未與外界接觸，傳染病的唯一途徑為母嬰垂直傳播，鑒于新生兒免疫系統(tǒng)未完全建立及胎盤有一定的屏障作用，篩查母血的傳染病指標有相當?shù)谋匾??？紤]到試劑靈敏度或標本混淆等因素的影響，臍帶血移植前，對移植臍帶血當初留樣的母血、臍帶血標本進行傳染病檢測，檢測結(jié)果完全一致。用凍存管保存的復檢標本儲存在-20 ℃冷庫，經(jīng)過多年的儲存，復檢標本量能夠滿足檢測，但是有部分標本的量變少或凍干(當初留樣為2管，凍干的啟用另一管)，復檢標本凍存管的密封性及保證復檢標本的量不減少是臍帶血儲存多于20年需要注意的問題。

凍存干細胞的方法有先暫存于-80 ℃冰箱，然后轉(zhuǎn)移至液氮中[9-10,14]。許利民等[9]曾報道，臍帶血干細胞在-80 ℃冰箱可以有效保存3個月，6個月后存在部分細胞損害，此時的臍帶血不適合作為干細胞移植。臍帶血經(jīng)過程控降溫后保存于-196 ℃的液氮中12個月、幾年甚至十幾年后，仍有很高的細胞活性[9-13]。通常認為-80 ℃時，細胞內(nèi)外各種溶質(zhì)基本達到平衡，此時細胞內(nèi)酶的活性基本消失，但仍有微量生命活動，仍然會消耗能量，不適合長時間保存。-196 ℃的液氮深低溫冷凍保存能阻斷各種酶的活性和細胞代謝，可長期保存細胞并保存細胞活力。

評價外周血干細胞主要是用體外方法檢測復溫后有核細胞、CD34+細胞和造血集落培養(yǎng)及細胞活性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，凍存前200份臍帶血的TNC均值為(11.2±4.8)×108，凍存20年后復蘇TNC均值為(10.1±4.0)×108，TNC回收率為90.18%，活性回收率為75.78%。許利民等[9]研究發(fā)現(xiàn)，凍存12個月后平均細胞活力仍為90.86%。時慶等[10]研究了凍存16年的34份臍帶血復蘇前后的情況，TNC回收率平均為79%。章毅等[11]比較了605份凍存干細胞的TNC回收率，1年內(nèi)為83.3%，1～2年為84.3%，>2～3年為84.7%，3年以上為85.9%。ANAGNOSTAKIS等[15]分析了105份液氮凍存6～36個月的臍帶血標本，平均TNC回收率為79.48%。LEE等[16]研究臍帶血TNC回收率、細胞活力并不與凍存時間呈負相關。推測凍存液氮后，細胞基本活動停止，其各項指標較入庫前有降低的情況，主要與凍存和復蘇的過程有關，細胞經(jīng)歷降溫和復溫的過程，會引起細胞內(nèi)形成冰晶及滲透壓改變，過程中有部分細胞不可避免地受到損傷。細胞活性有一定比例的損失，主要是已分化成熟的細胞，這部分細胞丟失并對移植影響不大。

CD34+細胞是造血干/祖細胞的一個重要表面標志，CD34+細胞及總有核細胞數(shù)能夠反映細胞的質(zhì)量。本研究采用雙平臺進行CD34計數(shù)，200份標本的平均CD34數(shù)目是凍存前的77.42%，發(fā)現(xiàn)TNC的損失接近10%，因為雙平臺的原因，CD34+實際數(shù)目比凍存前遠遠大于77.42%，鑒于雙平臺的誤差存在計數(shù)儀與流式細胞儀2個過程與設備，后續(xù)會嘗試采用單平臺的絕對計數(shù)。CFU-GM是造血干細胞增殖能力的指標，凍存20年的標本能夠很好地形成集落，說明干細胞有很強的增殖能力。

目前，臨床醫(yī)生考慮移植效果主要關注TNC、CD34+、CFU-GM和活性，凍存20年的臍帶血雖然指標較凍存前有所降低，但是細胞各項指標仍符合質(zhì)量標準。臨床醫(yī)生在選擇臍帶血時不需要過多關注臍帶血的凍存年限，更多的是需要關注臍帶血的質(zhì)量。