某生物醫(yī)藥廢水中乙腈降解菌的篩選與特性研究

邴 斌，韓 楊

（青島市市政工程設計研究院有限責任公司，山東青島 266100）

隨著各種工業(yè)包括人造纖維、石油化工和金礦等工業(yè)的不斷發(fā)展，含有有機腈類化合物的廢水也越來越多，如果不加以采取措施進行處理直接排放，將會對人類的健康以及生存環(huán)境造成很大的影響[1]。降解腈類微生物產(chǎn)生的腈水解酶是一種非常重要的工業(yè)用酶，可以在溫和的條件下將氰基水解成無毒的羧基和氨，由于腈水解酶具有高的化學選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性而備受人們的關注[2-3]。腈水解酶最早是由Thiman 和Mahadevan在1964 年從大麥葉中分離出來的[4]。許多研究者利用特定的腈類物質作為唯一碳源或者唯一氮源篩選到一系列可以產(chǎn)腈水解酶的微生物（包括細菌和真菌）以及植物。本研究針對目前工業(yè)生產(chǎn)帶來的環(huán)境污染問題，從生物降解角度出發(fā)，從污泥中分離篩選可以降解乙腈的降解菌株，并對其生物特性進行了研究，為該類廢水處理的工程設計提供依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 樣品的來源

選擇山東某制藥廠乙腈洗料車間下水道污泥中進行樣品的采集，取10個取樣點的污泥，這里含有大量洗料殘留的乙腈，利用富集培養(yǎng)的方法進行降解微生物的篩選。乙腈和乙酸分別購自百靈威公司，其他試劑都為分析純。

1.2 高活性腈水解酶菌種快速篩選策略

初篩：將所采集的污泥（1g）加入10mL 0.85%生理鹽水中，用振蕩器振蕩均勻，靜置25～30min。然后取2mL上清至250mL裝有50mL富集培養(yǎng)基（以乙腈作為唯一氮源）的搖瓶中進行第一次富集，30℃，150r/min培養(yǎng)3d，接著將第一次富集的培養(yǎng)液取3mL至第二批富集培養(yǎng)液中進行第二次富集，3d后進行第三次富集。經(jīng)過三輪富集培養(yǎng)后對培養(yǎng)液進行梯度稀釋涂布平板，30℃培養(yǎng)2～3d。挑取單菌落于含有200μL以乙腈為唯一氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，30℃， 150r/min，培養(yǎng)2d后，加入pH指示劑溴甲酚紫進行顯色，將顯黃色的菌從平板上挑取進行第二次復篩。

復篩：將初篩顯示黃色的菌種轉接到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，150r/min下，培養(yǎng)36～48h后，將發(fā)酵液離心9 000r/min，10min，將離心的菌體用生理鹽水洗滌三次，均勻懸浮于蒸餾水中制成一定濃度的菌懸液。取10mL菌懸液加入0.1g乙腈，降解一定的時間后，取樣進行氣相液相檢測分析。

1.3 最適降解條件的優(yōu)化方法

在10mL反應體系條件下，選取1%乙腈作為底物，不同轉化溫度為：20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃，在30 ℃，150r/min條件下降解一定的時間。在最優(yōu)溫度附近，選擇四個梯度35、45、55、65 ℃進行菌株的降解率穩(wěn)定性研究。

用6mol/L HCl和NaOH將自來水調至pH范圍為6.0～10.0不同梯度的水溶液作為反應體系，在30℃，150r/min條件下降解一定的時間，取出樣品進行GC檢測。為了考察不同pH的水溶液對菌株降解效率的穩(wěn)定性，本實驗選擇了四個pH不同的梯度：5、5.5、6、6.5，將降解菌株放于不同pH的水溶液中，置于0℃，定期取出于含有1%乙腈水溶液中，30℃，150r/min降解一定的時間。

2 結果和討論

2.1 溫度對降解率的影響

由于微生物胞內存在可以降解氰類物質的酶類，然而酶在降解乙腈物質的過程中起著至關重要的作用，然而溫度會影響酶的作用能力。如圖1所示，降解過程中，溫度為45℃時，降解率達到最高；溫度低于45℃時，降解效率隨著溫度的升高呈上升趨勢；溫度高于45℃時，降解效率開始下降，因此在用降解菌株處理含有乙腈的污水時，需要考慮溫度的因素，在此研究中，最適降解溫度為45℃。

在工業(yè)處理廢水中，考慮降解菌株的降解氰類化合物的持久性，溫度穩(wěn)定在最適溫度條件下是否穩(wěn)定，成為被常 研究的因素，因此，本研究在最適溫度45℃附近，選擇了35、45、55和65 ℃四個梯度進行了研究，最長處理時間達16h，從圖2A可以看出，降解菌在35℃較為穩(wěn)定；

圖1 溫度對降解率的影響

根據(jù)公式（1），得到圖2B的擬合斜率，可以計算得知：降解菌株在35、45、55和65 ℃條件下的Kd分別為：0.052 49、0.263 21、0.75633和1.524 27，接著根據(jù)公式（2），計算出4個溫度下所對應的半衰期（降解菌株的降解率下降至50%所需要的時間）分別為13.2、2.63、0.91和0.45h。

圖2 不同溫度下降解率的穩(wěn)定性（A）和擬合曲線（B）

2.2 污水 pH 對降解菌降解率的影響

在進行污水氰基化合物的降解過程中，污水不同的pH對降解菌株的降解率會產(chǎn)生一定的影響。本實驗將污水的pH調至6.0～10.0，對其降解率進行了考察，如圖3所示，在不同pH條件下，降解菌株的降解率是不同的，當pH為7.0時，降解率較高，可以達到100%；當pH低于7.0時，隨著pH的降低，降解率呈劇降趨勢；當pH高于7.0時，降解率仍然會處于下降趨勢，因此污水的pH需要調節(jié)在6.0～7.0。

圖3 不同 pH 的污水對降解率的影響

在考察了pH對降解率的影響前提下，進一步考察了降解菌在最適pH范圍內的穩(wěn)定性，本實驗采取了四個不同的pH來考察了降解菌pH的穩(wěn)定性，這4個pH分別為5、5.5、6.5、7。如圖4所示，pH在6.5時的降解率也是最穩(wěn)定的，基本與最適pH條件結果是吻合的。從整體的變化趨勢來看，該降解菌在微酸條件下還是較穩(wěn)定的。

圖4 不同 pH 下降解率的穩(wěn)定性

2.3 降解菌對乙腈的耐受研究

氰基化合物在較高的濃度下對降解菌是有一定的毒害作用，因此為了研究降解菌株對乙腈的最大耐受能力，在10mL降解體系中，分別加入不同濃度的乙腈，一定量的濕菌體量，30℃，150r/min降解一定的時間后取樣，進行降解率的分析。如圖5所示，降解菌在小于4% 乙腈范圍內，降解率隨著濃度的升高而升高，但當乙腈的濃度超過4%，降解菌的降解率則處于下降趨勢，從而了解到該降解菌可以耐受的乙腈濃度為4%。

圖5 降解菌株對污水中乙腈的耐受性

3 結論

從山東某制藥廠乙腈洗料車間的下水道的污泥中進行樣品的采集，經(jīng)過富集培養(yǎng)的方法，篩選分離到一株具有降解乙腈能力的菌株，對該菌株降解乙腈的條件包括溫度、pH和乙腈耐受程度做了研究，該降解菌最適降解溫度為45℃，且在35℃較為穩(wěn)定，該降解菌在微酸條件下還是較穩(wěn)定的，其耐受的乙腈濃度為4%，相關成果為該類廢水處理工程的設計提供了依據(jù)。