基于UPLC-Q-TOF-MS/MS及GNPS技術(shù)的炮附片二萜類生物堿成分*

范倩，陳雪冰，汪玉梅，榮莉，張翠仙

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006

附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata）為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx. 子根的加工品，具有回陽救逆、補火助陽，散寒除濕之功效等［1］。臨床用于治療陰盛格陽，大汗亡陽，風(fēng)寒濕痹等疾病。文獻(xiàn)研究表明［2-4］附子的化學(xué)成分主要為生物堿、有機酸類、脂肪酸酯和微量元素等，其中生物堿為主要活性成分，具有強心、抗炎和抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等藥理作用。附子生物堿主要包括雙酯型二萜類生物堿、長鏈脂型二萜類生物堿、單酯型二萜類生物堿、無酯型二萜類生物堿和其他類型生物堿。其中雙酯型和單酯型二萜類生物堿也為其毒性成分。由于附子屬于大毒藥材，臨床常用其炮制品，炮制過程中雙酯型生物堿水解成單酯型生物堿，毒性顯著降低等［5］。近年來，將液相色譜的高效分離能力和高分辨質(zhì)譜鑒定能力相結(jié)合，廣泛用于中藥材成分分析與鑒定［6］。GNPS（global natural products social molecular networking）是一種可視化計算策略，可以直觀地觀察到樣品LC-MS/MS 實驗中檢測到的所有分子離子以及這些分子離子之間的化學(xué)關(guān)系，對于化合物的快速而大規(guī)模地鑒定及新穎化合物發(fā)現(xiàn)具有重要的作用［7］。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 及GNPS 技術(shù)對炮附片在線分離分析，快速鑒定其二萜類生物堿成分，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Triple-TOFTM 5600+型三重四級桿飛行時間質(zhì)譜（美國AB SCIEX 公司）。超高效液相系統(tǒng)：LC-30AD 高效液相色譜儀、SIL-30AC 自動進(jìn)樣器（日本Shimadzu 公司）；煎煮鍋（廣州文新電器有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；盧湘儀DD-5M 低速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；Sartorius 賽多利斯十萬分之一天平（季爾國際貿(mào)易有限公司）。

炮附片藥材（批號YPA7H0001）購自廣州采芝林藥業(yè)有限公司。炮附片，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)黃海波教授鑒定為烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品。對照品烏頭堿（aconitine，批號RP170421）、 中 烏 頭 堿（mesaconitine， 批 號RP170320）、 次 烏 頭 堿（hypaconitine， 批 號RP170520）、3-脫氧烏頭堿（3-deoxyaconitine，批號RP161108）、苯甲酰烏頭原堿（benzoylaconine，批號RP170615）、苯甲酰中烏頭原堿（benzoylmesaconine，批號RP170605）、苯甲酰次烏頭原堿（benzoylhypaconine，批號RP170513）、烏頭原堿（aconine，批號RP170517）、新烏頭原堿（mesaconine，批號RP170320）、次烏頭原堿（hypaconine，批 號 RP170518）、 尼 奧 林 （neoline， 批 號RP170423）、 多 根 烏 頭 堿（karacoline， 批 號RP161225）、宋果靈（songorine，批號RP170402），均購自成都麥德生科技有限公司，13 種對照品純度均≥98%。甲醇（色譜純，德國Merck 公司），甲酸（色譜純，美國Fisher 公司），φ=95%乙醇（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 ACE C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司），體積流量0.4 mL/min，PDA 全波長掃描，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL。以乙腈為流動相A，φ=0.1%甲酸水為流動相B，梯度洗脫：0～5 min，5% A；5～65 min ，5%～25 % A；65～95 min，25%～65% A；95～100 min，65%～95%A；100～105 min，95%A。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化源（ESI），正離子掃描模式，掃描范圍m/z 100～1 500，用亮氨酸腦啡肽作校正液，進(jìn)行實時校正。正離子模式離子噴霧電壓（ISVE）：+5 500 V；渦輪噴霧溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣壓力（GUR）：35 psi；霧化氣（Gas1）：55 psi；輔助氣（Gas2）：55 psi；解簇電位（DP）：100 V；碰撞能散布（CES）：15 eV；離子釋放延遲（IRD）：67 V；離子釋放寬度（IRW）：25 V 一級質(zhì)譜母離子掃描范圍100～1 500 ；IDA 設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps 的8 個最高峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍：100～1 500。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品儲備液的溶液 用十萬分之一天平精密稱取13 種附子對照品各約1.0 mg，用φ=80%的甲醇溶解，定容至1 mL 容量瓶中，分別精密吸取13 種附子對照品各0.1 mL，定容至50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度約為0.02 mg/mL 的附子混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取炮附片藥材30.0 g，精密稱定，加入1 L純凈水浸泡30 min，水煮2 h制成水煎液，趁熱用四層紗布過濾，藥渣采用此方法再煎煮一次后合并兩次濾液，離心（4 000 r/min，15 min），上清濾液濃縮至約300 mL后加3倍φ=95%的乙醇沉糖，于4 ℃冰箱靜置24 h，離心（4 000 r/min，15 min），上清液在50 ℃減壓濃縮至粘稠狀態(tài)，氮氣吹干儀吹干部分溶劑，得稠浸膏。取浸膏適量，用φ=80%甲醇水配制成質(zhì)量濃度約為50 mg/mL 的樣品溶液，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 化學(xué)數(shù)據(jù)庫分析 使用Peak ViewTM軟件（版本1.2，AB Sciex）對炮附片中復(fù)雜的化合物進(jìn)行定性鑒別。首先，通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)和化學(xué)數(shù)據(jù) 庫 網(wǎng) 站（CNKI，Chemspider，Web of Science，PubMeb，SciFinder 等），建立了一個屬于附子的化合物數(shù)據(jù)庫，包括名稱、分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)文件。然后，將數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入到Peak ViewTM軟件的XIC Manager 模塊對目標(biāo)化合物進(jìn)行峰提取和匹配。提取的參數(shù)設(shè)置如下：XIC intensity ＞50 counts，S/N ＞ 10， isotope ratio% difference ＜20， mass error ＜10×10-6。經(jīng)計算篩選后，軟件將各化合物的實測數(shù)據(jù)與軟件理論的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，將匹配度大于75%且質(zhì)譜碎片裂解過程合理的結(jié)果作為炮附片中最終鑒定出來的化合物。

2.3.2 GNPS 網(wǎng)絡(luò)的建立 按照“2.1”項下優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣，獲得正離子模式下炮附片樣品及混合對照品溶液的UPLC-Q-TOF-MS/MS二級質(zhì)譜文件，通過MS Convert 軟件轉(zhuǎn)換后利用FileZilla FTP Client 連接器導(dǎo)入GNPS 平臺（http：//gnps. ucsd. edu），分別建立GNPS 網(wǎng)絡(luò)，并與混合對照品和譜庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配；數(shù)據(jù)分析在Cytoscape 3.6.1 軟件中進(jìn)行。

3 討 論

3.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS 條件優(yōu)化及參數(shù)設(shè)置

中藥炮附片的提取物成分復(fù)雜多樣。通過與樣品的正負(fù)離子響應(yīng)度比較，發(fā)現(xiàn)正離子比負(fù)離子具有更好的響應(yīng)。為了有足夠的碎片信息用于結(jié)構(gòu)鑒定分析，以13 種生物堿溶液的對照品為參考，選擇20、30、40 和50 eV 的碰撞能量（CE）進(jìn)行優(yōu)化以獲得合適的產(chǎn)物離子，最后選擇40 eV作為最佳CE。

本實驗采用了四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（QTOF-MS/MS），無論是在MS 或MS/MS 模式下均具有高分辨能力，在實現(xiàn)UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析時其主要優(yōu)點是應(yīng)用質(zhì)譜的高分辨精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行化合物的定性分析，加上MS/MS 數(shù)據(jù)以推測分子結(jié)構(gòu)，對于高分辨率質(zhì)譜通常要求儀器的質(zhì)量測量準(zhǔn)確度小于10×10-6［8-10］，才能滿足定性分析的需要；利用Peak ViewTM軟件里的XIC Manager 模塊對化學(xué)數(shù)據(jù)庫里化合物進(jìn)行峰提取和匹配的參數(shù)的篩選標(biāo)準(zhǔn)限值，該匹配度僅作為一個化合物定性分析的初步篩選標(biāo)準(zhǔn)，提取并突出顯示初步符合數(shù)據(jù)庫要求的化合物；同時，我們也參考了相關(guān)的文獻(xiàn)（如：復(fù)方白術(shù)芍藥散成分分析）［8］里該匹配度值的設(shè)置情況。故本實驗選用了mass error ＜10×10-6作為質(zhì)量測量準(zhǔn)確度的標(biāo)準(zhǔn)，匹配度大于75%作為炮附片的定性分析的初步標(biāo)準(zhǔn)。此外，化合物的定性分析需要同時滿足質(zhì)量測量準(zhǔn)確度（mass error） 小于10×10-6和匹配度大于75%，并需結(jié)合各化合物的特征二級碎片離子等，最終才能鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。

3.2 炮附片的成分鑒定

按照“2.1”項下優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣，獲得UPLC-Q-TOF-MS/MS 正離子模式下炮附片樣品和混合對照品溶液的TIC圖（見圖1）。按照“2.3”項下數(shù)據(jù)分析方法確定化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，對炮附片主要成分進(jìn)行快速表征，共鑒定了123個化合物（見表1、表2），其中包括雙酯型生物堿21個，脂型生物堿11 個，單酯型生物堿43 個，無酯型生物堿47 個，多酯型生物堿1 個，其中包括34個潛在的新化合物。

3.2.1 通過數(shù)據(jù)庫和Peakview 對二萜類生物堿的成分鑒定

1） 雙酯型二萜類生物堿。

雙酯型二萜類生物堿（DDAs）是附子的主要生物活性成分，通過建立的LC-MS 方法，在炮附片的水煎液中一共鑒別了17 種雙酯型二萜類生物堿，該類化合物的主要裂解特征為容易脫去取代基，如羥基、甲氧基、乙?；?、苯甲?；?，而丟失CO、H2O、CH3OH、AcOH、BzOH 等中性分子?；衔?7、94、103 和109 通過對照品無偏差的鑒別為aconitine、mesaconitine、hypaconitine 和3-deoxyaconitine。為幫助鑒定和證實其他雙酯型二萜類生物堿，我們首先對mesaconitine 對照品的碎片裂解途經(jīng)進(jìn)行分析，在正離子模式檢測下，化合物94 （mesaconitine） 給出了明顯的m/z 632.305 4 ［M+H］+的分子離子峰， 二級質(zhì)譜圖（圖2A）可觀察到碎片離子m/z 582.269 1［M+HCH3OH-H2O］+、572.280 9［M+H-AcOH］+、540.256 2［M+H-AcOH-CH3OH］+、512.261 9［M+H-AcOHCH3OH-CO］+、508.231 8［M+H-AcOH-2CH3OH］+、480.236 9［M+H-AcOH-2CH3OH-CO］+、480.236 9［M+H-AcOH-2CH3OH-CO］+、390.228 0［M+H -AcOH-CH3OH-CO-BzOH］+、354.169 0［M+HAcOH-CH3OH-CO-BzOH-2H2O］+；其裂解規(guī)律如圖3所示。其他雙酯型生物堿（化合物72、81、84和108）均有類似的質(zhì)譜裂解規(guī)律，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報道［11］，分別鑒定為17-dihydronapelline、3*、10-hydroxymesaconitine、chasmaconitine。研究發(fā)現(xiàn)化合物74 和化合物94（mesaconitine）具有相同的分子式C33H45NO11，其為mesaconitine的同分異構(gòu)體。 其二級質(zhì)譜中形成的m/z 572.280 9［M+H-AcOH］+主要碎片離子，同時觀察到其碎片離子m/z 540.258 0［M+H-AcOHCH3OH］+、508.265 9［M+H-AcOH-2CH3OH］+。但因未發(fā)現(xiàn)［M+H-H2O］+和［M+H-CH3OH -H2O］+等與脫去H2O相關(guān)的碎片離子，說明其C3位未有羥基取代，根據(jù)文獻(xiàn)［12］比對，推測化合物74 其可能為10-OH-hypaconitine。類似地，其他雙酯型二萜類生物堿化合物，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)報道及ClogP 值［8，10-11］，79、82、91、95、96、102和110～112逐一被鑒定（表1）。

圖1 炮附片（A）和混合對照品溶液（B）的UPLC-Q-TOF-MS/MS 總離子流圖Fig.1 The total ion chromatograms of PAC and mixed reference solution by UPLC-Q-TOF-MS/MS

表1 炮附片中已知二萜類生物堿離子結(jié)構(gòu)信息1）Table 1 Characterization of known diterpenoid alkaloids of PAC by UPLC-Q-TOF-MS/MS

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

表2 炮附片中新二萜類生物堿離子結(jié)構(gòu)信息1）Table 2 Characterization of new diterpenoid alkaloids of PAC by Molecular Networking

續(xù)表

2） 長鏈脂型二萜類生物堿。

長鏈脂型二萜類生物堿（Lipo-As）是附子中特有的一類生物活性成分，該類化合物的主要質(zhì)譜裂解特征為首先脫去C-8 為對應(yīng)的長鏈脂肪酸（-lipo）后，再與其相對應(yīng)的雙酯型二萜類生物堿［M+H-AcOH］+的骨架的二級質(zhì)譜裂解規(guī)律是一致的［15］?；诖肆呀庖?guī)律，從炮附片中一共鑒定到了11 個長鏈脂型生物堿。例如，化合物122 的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 812.531 2［M+H］+，分子式為C47H73NO10。二級質(zhì)譜圖如圖2 B 可觀察到碎片離子m/z 556.289 2［M+H-lipo］+、524.262 6［M+H-lipo-CH3OH］+、496.269 5［M+H-lipo- CH3OH-CO］+、338.172 5［M+H-lipo-3CH3OH-BzOH］+。其二級質(zhì)譜和benzoylhypaconine 二級質(zhì)譜一致，因此，該化合物的骨架初步鑒定為benzoylhypaconine，其長鏈脂肪酸的分子式為C16H32O2，推測長鏈脂肪酸初步為palmitic acid （pal）。根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報 道［11］，化 合 物122 鑒 定 為8-pal-benzoylhypaconine。此外，其他長鏈脂型二萜類生物堿化合物也有類似的裂解規(guī)律，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報道［12-13］，化合物113～117、119～123 逐一被鑒定表征（表1）。

3） 單酯型二萜類生物堿。

單酯型二萜類生物堿（MDAs）是炮附子中主要的低毒活性成分，通過建立的LC-MS 方法在炮附片的水煎液中一共鑒別了34 種單酯型二萜類生物堿，其裂解規(guī)律為容易失去AcOH、CH3OH、H2O、CO 等中性分子?；衔?7、73 和75 通過對照品無偏差的鑒別為benzoylmesaconitine，benzoylaconine 和benzoylhypaconine。為鑒定和證實其它單酯型二萜類生物堿，首先對benzoylaconine 對照品的碎片裂解途經(jīng)進(jìn)行分析，在正離子模式檢測下，化合物73（benzoylaconine）給出了明顯的m/z 604.312 0［M+H］+的分子離子峰， 二級質(zhì)譜圖（圖2C）可觀察到碎片離子m/z 586.300 8［M+HH2O］+、572.285 6［M+H-CH3OH］+、554.275 2［M+H-H2O-CH3OH］+、540.259 3［M+H-2CH3OH］+、522.248 9［M+H-2CH3OH -H2O］+、508.233 6［M+H -3CH3OH］+、490.222 4［M+H-3CH3OH-H2O］+、428.186 6［M+H-BzOH-3H2O］+；此外，其他單酯型二萜類生物堿均有類似的質(zhì)譜裂解規(guī)律，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報道［11-12，14-16］，化合物1、24、26、37、47、53、54、56、57、65、76、80、88、90、93、98 和99 逐一分別被鑒定。在正離子模式下，化合物62出現(xiàn)m/z 604.312 2［M+H］+的準(zhǔn)分子離子峰，它的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與benzoylaconine 相類似，二級質(zhì)譜圖同樣可觀察到m/z 572.287 7、554.277 5和522.251 1等碎片離子，對比之下化合物62 還具有m/z 458.198 9［M+H-4CH3OH-H2O］+、336.159 4［M+H-4CH3OH-BzOH-H2O］+特征的碎片離子，暗示其比benzoylaconine 多一個-OCH3，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報道［12］，推測其結(jié)構(gòu)為hukbusine A。其他單酯型二萜類生物堿化合物均有類似的質(zhì)譜裂解規(guī)律，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報道及ClogP 值［11，17-19］，化合物69、71、78、83、85～87、100、101和104～107逐一被鑒定（表1）。

圖2 Mesaconitine（A）、8-pal-benzoylhypaconine（B）、benzoylaconine（C）、neoline（D）、PAC-2#（E）和PAC-16#（F）的二級質(zhì)譜圖Fig.2 The MS2 spectra of mesaconitine（A），8-pal-benzoylhypaconine（B），benzoylaconine（C），neoline（D），PAC-2#（E）and PAC-16#（F）

4） 無酯型二萜類生物堿。無酯型二萜類生物堿（ADAs）是炮附子中主要的無毒活性成分，通過建立的LC-MS 方法，在炮附片的水煎液中一共鑒別了25 種無酯型二萜類生物堿，化合物12、15、20、23、28 和33 通過對照品無偏差的鑒別為mesaconine、karakoline、songorine、aconine、hypaconine 和neoline；以化合物33 為例，說明無酯型二萜類生物堿的裂解規(guī)律?；衔?3 二級質(zhì)譜圖如 圖2D 可 觀 察m/z 420.274 7［M+H-H2O］+、402.264 1［M+H-2H2O］+、388.248 6［M+H-H2OCH3OH］+、370.237 9［M+H - 2H2O - CH3OH］+、356.222 2［M+H-H2O -2CH3OH］+等碎片離子，根據(jù)對照品的質(zhì)譜信息和參考文獻(xiàn)報道［12］，化合物33 初步鑒定為neoline。而化合物36 的裂解方式和化合物33 的相似，它的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與neoline 相類似，二級質(zhì)譜圖同樣可觀察到m/z 420.274 0、388.248 6、360.217 5 等碎片離子，對比之下，化合物36 還形成m/z 406.259 4 的主要的特征二級碎片離子，是在m/z 438.285 3 的母離子脫去C1位的-CH3OH 產(chǎn)生的，表明其C1是甲氧基取代。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合參考文獻(xiàn)［11］，因此推測其結(jié)構(gòu)為foresticine。其他無酯型二萜類生物堿化合物類似的質(zhì)譜裂解規(guī)律，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報道及ClogP 值［11-13，15-16］，化 合 物2，4，6～9，14，29，40和48逐一被鑒定（表1）。

3.2.2 通過GNPS 網(wǎng)絡(luò)對二萜類生物堿的成分鑒定 基于MS/MS 光譜的相似性，炮附片水煎煮液的可視化的分子籠網(wǎng)絡(luò)被建立（https：//gnps. ucsd. edu/ProteoSAFe/status. jsp？task=7c62374c03854 e01ad1ad354134c7616）。在4 個明顯的二萜類生物堿分子籠中，通過GNPS 網(wǎng)絡(luò)和已知化合物的去重復(fù)分析，共初步鑒定了65 個生物堿，其中包括34個潛在的新生物堿（表2和圖4）。

圖3 Mesaconitine的質(zhì)譜裂解規(guī)律圖Fig.3 The proposed fragmentation pathways of mesaconitine

在正離子模式下，分子籠Ⅰ共包含了36 個節(jié)點，相對分子質(zhì)量范圍在m/z 320.114～588.280 之間，結(jié)構(gòu)涉及單酯型和無酯型生物堿（圖5A）。特別地，通過對比對照品（表1），節(jié)點m/z 378.264［M+H］+被鑒定為已知化合物karakanine（18）。此外，通過文獻(xiàn)報道和數(shù)據(jù)庫分析［11］，節(jié)點m/z 420.275（35）和392.280（1）［M+H］+分別被鑒定為N-ethylhokbusine B（35）和hukbusine B 或它的同分異構(gòu)體（1）。與此同時，如圖分子籠I 所示，未知離子m/z 396.264 與已知離子m/z 378.264 相關(guān)，表明它們在結(jié)構(gòu)上類似。節(jié)點m/z 396.264 產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子峰為396.236 3［M+H］+，其二級碎片為m/z 378.254 5［M+H-H2O］+、360.244 2［M+H-2H2O］+、342.234 7［M+H-3H2O］+、324.223 6［M+H-4H2O］+、268.203 9［M+H-2CH3OH-H2O-CO］+，二級質(zhì)譜顯示有多個中性水分子的丟失，推測結(jié)構(gòu)中存在多個羥基，基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，節(jié)點m/z 396.26 被鑒定為karakoline 的衍生物（PAC-2#（5），表2 和圖4）。此外未知離子m/z 434.290 比已知離子m/z 420.275 高出14 ，節(jié)點m/z 434.290 的準(zhǔn)分子離子峰為396.236 3［M+H］+，其二級碎片為402.255 3［M+H-H2O］+、384.249 5［M+H-2H2O］+、342.243 2［M+H-AcOH］+、324.233 2［M+H-AcOH-H2O］+、292.204 6［M+H-AcOH-H2OCH3OH］+，二級質(zhì)譜顯示有中性乙酸分子的丟失，推測結(jié)構(gòu)中存在1 個乙?；谖墨I(xiàn)報道［11］結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)，節(jié)點m/z 434.290 被鑒定為N-ethylhokbusine B 的衍生物（PAC-16#（50），表2 和圖4）。通過GNPS 網(wǎng)絡(luò)分析，在分子籠Ⅰ中，我們共鑒定了26 個生物堿，其中包含15 個新的生物堿。此外，在分子籠Ⅱ中共鑒定21 個生物堿，其中包含11 個新的生物堿；在分子籠Ⅲ中共鑒定7 個生物堿，其中包含1個新的生物堿；在分子籠Ⅳ中共鑒定11 個生物堿，其中包含7 個新的生物堿（表2和3，圖5C～D）。最后將通過GNPS 分子網(wǎng)絡(luò)推導(dǎo)的所有潛在的新化合物結(jié)構(gòu)分別輸入Sci Finder 數(shù)據(jù)庫搜索驗證，發(fā)現(xiàn)其34 個潛在的化合物均未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，故推測此34 個潛在的化合物均為炮附片中潛在的新化合物。

4 結(jié) 論

圖4 炮附片中新二萜類生物堿成分Fig.4 The structures of the new diterpenoid alkaloids compounds identified from PAC

圖5 炮附片中4個二萜類生物堿分子籠Fig. 5 The 4 clusters of the diterpenoid alkaloids from PAC

為全面分析炮附片的二萜類生物堿成分并挖掘其潛在的新成分，本研究采用了GNPS 分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS/MS 策略，對PAC 的成分進(jìn)行快速表征。并根據(jù)化合物之間的MS/MS 相似性，PAC 提取物的GNPS 分子網(wǎng)絡(luò)被建立，通過GNPS分子網(wǎng)絡(luò)去重復(fù)分析，成功地鑒定了與二萜類生物堿相關(guān)的4個分子籠。利用上述方法在PAC提取物中共鑒定了123 個二萜類生物堿，其中包括34個新二萜類生物堿。這些發(fā)現(xiàn)極大地擴展了我們對炮附片的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識，有助于為進(jìn)一步全面了解其藥理活性，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究奠定了基礎(chǔ)。