基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的作用機制

李和教，黃毅嵐，黃易

1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，海南 ?？?570102；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川 瀘州 646000

血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)是由腦血管病變或由血管性因素導(dǎo)致與之有關(guān)的認(rèn)知損害，亦是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)退行性疾病[1]，主要以學(xué)習(xí)、記憶及社交等能力降低為主要的疾病特點認(rèn)知功能障礙[2]，多發(fā)于中老年。隨著社會的老齡化，血管性認(rèn)知障礙對人們的健康及生活質(zhì)量的影響越來越明顯及其發(fā)病率較高，甚至進展成癡呆，這不僅給患者的健康及生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重的影響，還給社會及其家庭帶來嚴(yán)峻的考驗[3]。目前在臨床及基礎(chǔ)研究針對血管性認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機制亦尚未明確，且在臨床治療上沒有療效確切的藥物和治療方案[4]；在中醫(yī)上采用辨證論治方法，以滋益固腎、活血化瘀、化痰開竅的治療原則治療及改善患者的血管性認(rèn)知功能障礙的癥狀方面取得良好的臨床效果。

血府逐瘀湯是治療“胸中血府淤血”的常用理血藥方之一，具有活血化瘀、行氣通絡(luò)之效，對血管性癡呆具有明顯改善作用[5]。有研究顯示通過多成分、多層面、多靶點及多通路研究及分析該方所包含的活血化瘀中藥，發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯及其活性成分具有減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善機體微循環(huán)障礙等作用，在一定程度可改善或延緩認(rèn)知功能障礙的惡化[6-9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等研究方法，通過“成分-潛在靶點-分子通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，從整體上對中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用進行系統(tǒng)和多層次的解析[10-12]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選血府逐瘀湯的活性成分靶點，構(gòu)建“活性成分-潛在靶點”和“成分-潛在靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，尋找潛在通路，探討血府逐瘀湯通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮治病作用的機制，為其臨床應(yīng)用提供證據(jù)，更為血管性認(rèn)知功能障礙的臨床干預(yù)治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 血府逐瘀湯活性成分的篩選 通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索血府逐瘀湯的活性成分，根據(jù)OB%≥30%和DL≥0.18 條件[13]篩選血府逐瘀湯的活性成分，并且通過PuChem 數(shù)據(jù)查詢活性成分對應(yīng)的結(jié)構(gòu)式(SMILES)將所得信息錄入Excel 表格，且下載2D和3D結(jié)構(gòu)。

1.2 血府逐瘀湯活性成分靶點反向預(yù)測 通過將SMILES 依次輸入SWISS 數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)[14]中的SWISS，以“人類”為研究物種預(yù)測活性成分的靶點，整合去重得到血府逐瘀湯的作用靶點。

1.3 血管性認(rèn)知功能障礙的靶點獲取 利用“vascular cognitive impairment”作為關(guān)鍵詞，對Gene-Card等數(shù)據(jù)庫進行疾病靶點的檢索及篩選。整合去除重復(fù)靶點，即可獲得血管性認(rèn)知功能障礙的相關(guān)靶點。

1.4 構(gòu)建活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖 利用韋恩圖(Venn diagram)得到成分靶點與疾病靶點的交集，即潛在靶點，使用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(node)分別為活性成分和潛在靶點；邊(edge)表示三者的相互關(guān)系。使用Cytoscape 中Network Analysis 插件對相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)湫再|(zhì)分析，根據(jù)節(jié)點連接度(degree)和介數(shù)中心性(betweenness centrality)設(shè)置網(wǎng)絡(luò)樣式，節(jié)點大小反映degree大小，邊的粗細(xì)反映betweenness centrality大小。

1.5 蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點篩選 將血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的潛在靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，得到潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出結(jié)果，將結(jié)果中的node1、node2、combined score信息以TXT格式導(dǎo)入Cytoscape軟件中進行可視化和Network Analyzer分析，以節(jié)點degree 值反映靶點大小和顏色，從而構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。以節(jié)點度值(degree)和介數(shù)中心度(betweenness centrality)大于等于所有點中位數(shù)值2倍的靶點，并滿足接近中心度(closeness centrality)大于所有點中位數(shù)值條件篩選關(guān)鍵靶點作為血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的“關(guān)鍵靶點”，研究關(guān)鍵靶標(biāo)可能存在的藥理作用。

1.6 GO 與KEGG 通路富集分析 通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵靶點進行GeneOntology 分析(生物過程、分子功能和細(xì)胞成分三個層面)和Pathways分析，保存并整理結(jié)果，篩選排名靠前的生物過程或信號通路，通過Omicshare進行可視化。

1.7 構(gòu)建活性成分-潛在靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖 根據(jù)KEGG 分析結(jié)果篩選出關(guān)鍵基因富集基因數(shù)相對大的通路，通過Cytoscape 軟件構(gòu)建活性成分-潛在靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 血府逐瘀湯的活性成分篩選結(jié)果 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫以及文獻分別檢索血府逐瘀湯的活性成分及相應(yīng)靶點等信息，滿足OB＞30%和DL＞0.18 條件的成分作為主要活性成分，共得到活性成分212個，其中桃仁23 個、紅花22 個、當(dāng)歸2 個、川芎7 個、赤芍29 個、牛膝20 個、柴胡17 個、桔梗7 個、甘草23 個、枳殼5 個、地黃57 個，去重及去除無結(jié)構(gòu)式的活性成分后有105個活性成分，部分主要活性成分見表1。

表1 血府逐瘀湯的主要活性成分信息

2.2 構(gòu)建血府逐瘀湯活性成分-血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的潛在靶點藥理網(wǎng)絡(luò) 活性成分-潛在靶點藥理網(wǎng)絡(luò)共包括147個節(jié)點和519個邊，該網(wǎng)絡(luò)包含了88個化合物節(jié)點和59個潛在靶點節(jié)點(圖1)。紅色(node)：潛在靶點；深藍(lán)色(node)：活性成分；這些潛在的活性成分與靶點產(chǎn)生519個相互作用關(guān)系。通過Network Analyzer對網(wǎng)絡(luò)圖進行分析，結(jié)果顯示：與潛在靶點相互作用的活性成分中，甘草查爾酮B、刺槐黃素、刺果甘草查耳酮、橙皮素、柚皮素、槲皮素、山奈酚、甘草寧G、漢黃芩素等大于活性成分的中位數(shù)度值，即與6個以上靶點連接，是血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的主要成分；在這個網(wǎng)絡(luò)中，藥物活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，一種成分對應(yīng)多個靶點，一個靶點也對應(yīng)多種成分，這體現(xiàn)了其多成分、多靶點的作用特點。

圖1 血府逐瘀湯的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用STRING網(wǎng)站對得到的血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的潛在靶點進行分析，為獲得更加簡潔PPI網(wǎng)絡(luò)，首先刪除了自相作用關(guān)系蛋白邊，再刪除沒有相互作用蛋白的節(jié)點，在使用Cytoscape軟件構(gòu)建潛在蛋白質(zhì)-潛在蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)(圖2)。PPI網(wǎng)絡(luò)中有59個節(jié)點和588 個邊緣。PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點的大小與其在網(wǎng)絡(luò)中的度值呈正相關(guān)。節(jié)點的度值越大，它在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要，相應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點在疾病過程中有著更重要的作用。而在PPI圖中，用紅色飛鏢形代表關(guān)鍵蛋白、黃色飛鏢形代表其他主要蛋白、藍(lán)色圓形代表其他相關(guān)蛋白，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中APP(Degree34)、MAPK 1(Degree34)、TNF (Degree61)、FGF2 (Degree37)、EGFR(Degree38)、VEGFA(Degree39)、IL6 (Degree40)、AKT1(Degree44)蛋白質(zhì)節(jié)點的程度較高，大于節(jié)點中位數(shù)對應(yīng)的度的2 倍以上，這些靶點蛋白可能在血管性認(rèn)知功能障礙的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，見表2。

表2 血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵靶點

2.4 生物通路富集分析 使用DAVID網(wǎng)站對血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵靶點進行GO富集分析，得到了P＜0.05的GO條目共計40個，其中包含生物過程(biological process，BP)條目共26 個，最顯著的為ERK1 和ERK2 級聯(lián)正調(diào)控、MAP 激酶活性的正調(diào)節(jié)、MAPK 級聯(lián)、蛋白激酶B 信號的正調(diào)控等；細(xì)胞組成(cell composition，CC)分析結(jié)果一共有9條，最顯著的為細(xì)胞表面、質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、細(xì)胞核等；分子功能(molecular function，MF) 分析結(jié)果共有5條，最顯著的為酶結(jié)合、ATP結(jié)合、肝素結(jié)合、細(xì)胞因子活性、ATP 結(jié)合等，各類分別取前20 條。通過對血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵靶點進行KEGG 通路分析得到了P＜0.05 的通路共44條，包括PI3K-Akt(磷酸肌醇-3羥激酶/蛋白激酶B)通路、HIF-1(缺氧誘導(dǎo)因子1)信號通路、MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路、TNF(腫瘤壞死因子)信號通路、FoxO 信號通路、Ras 信號通路、Toll 樣受體信號通路等，見圖3。此20 條作用通路均與血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙相關(guān)的4 個以上靶基因富集重疊，揭示血府逐瘀湯的有效成分可能通過作用于以上多條信號通路來治療血管性認(rèn)知功能障礙。相關(guān)通路信息及富集基因見表3。

圖2 血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的潛在靶點的蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

圖3 GO和KEGG富集分析

表3 血府逐瘀治療血管性認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵通路

圖4 血府逐瘀湯的“活性成分-潛在靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 構(gòu)建血府逐瘀湯活性成分-潛在靶點-通路網(wǎng)絡(luò) 為研究血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的主要作用通路，本研究將血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙作用的8 個關(guān)鍵靶點蛋白置入DAVID 數(shù)據(jù)庫中進行通路富集分析，將結(jié)果中含有特殊疾病信號通路刪除，并將結(jié)果在Cytoscape軟件中構(gòu)建血府逐瘀湯活性化合物-疾病靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖4。共有163個節(jié)點和582 個邊，有88 個血府逐瘀湯中的化合物，59個主要的血管性認(rèn)知功能障礙潛在靶點和16 個通路。其中PI3K-Akt 信號通路含有6 個蛋白被富集，HIF-1 信號通路有5 個蛋白被富集，Ras 信號通路有5個蛋白被富集，MAPK 信號通路有5 個蛋白被富集，F(xiàn)oxO 和腫瘤壞死因子通路有4 個蛋白被富集，VEGF信號通路有5 個蛋白被富集，其余通路富集蛋白數(shù)量見表3。

3 討論

血管性認(rèn)知功能障礙是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)退行性疾病，隨著年齡的增長，其對健康和生活質(zhì)量的影響越來越明顯，發(fā)病率也越來越高，甚至?xí)l(fā)展為癡呆，這不僅嚴(yán)重影響了患者的健康和生活質(zhì)量，而且也給社會和家庭帶來了嚴(yán)峻的考驗[3]。針對血管性認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機制，目前臨床及基礎(chǔ)研究尚無定論，在臨床治療中也無療效確切的藥物和方案[4]。中醫(yī)采用辨證論治方法，以滋養(yǎng)腎、活血化瘀、化痰開竅為原則治療血管性認(rèn)知功能障礙，取得較好的臨床效果。血府逐瘀湯是治療“胸中血府淤血”的常用理血方劑之一，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，對血管性癡呆有明顯的改善作用[5]。研究顯示，通過多成分、多層面、多靶點、多通路研究及分析血府逐瘀湯及其有效成分，發(fā)現(xiàn)具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥、改善機體微循環(huán)障礙等作用，并在一定程度上改善或延緩認(rèn)知功能障礙的惡化[6-9]。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究血管性認(rèn)知功能障礙相關(guān)藥物及其作用機理，為臨床和基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)，對緩解臨床癥狀和改善預(yù)后具有重要意義[15]。

本研究分析結(jié)果顯示，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索血府逐瘀湯中各味藥的活性成分，并篩選出口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性值(DL)≥0.18 的血府逐瘀湯活性成分，共得到105 個有效活性成分和59個血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的主要潛在靶點。分析圖1 可見，有些化合物能調(diào)節(jié)多個作用靶點，比如甘草查爾酮B 可調(diào)控14 個潛在靶點、柚皮素能影響12 個潛在靶點、懈皮素可以調(diào)控10個潛在靶點等，但有少部分化合物只能調(diào)節(jié)一個靶點，比如β-胡蘿卜素僅作用于RBP4 靶點；反過來，一些關(guān)鍵蛋白也能被多種化合物調(diào)節(jié)和作用，但有部分蛋白質(zhì)也只受一個化合物調(diào)節(jié)及影響。如AKT1 蛋白被12 種化合物調(diào)控，EGFR 可被31 種化合物調(diào)控，而TGFBR2、HLA-DRB1 和VCAM1 僅由一個化合物調(diào)控，這說明血府逐瘀湯具有多成分、多靶點間相互作用和作用的特點，一些關(guān)鍵化合物作用于關(guān)鍵靶點起到治療疾病的主要作用。

血府逐瘀湯治療VCI 有8 個關(guān)鍵靶點，44 條信號通路和40條GO生物功能過程，主要是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖周期、激酶活性、胰島素抵抗、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和TNF 通路等多靶點、多途徑、多層面發(fā)揮作用，有效地改善及治療血管性認(rèn)知功能障礙的作用。在圖4中可見，一共有163個節(jié)點和582個邊，該網(wǎng)絡(luò)包含88個化合物、59個潛在靶點和16個通路。通過GO和KEGG富集分析可見，關(guān)鍵靶點TNF、EGFR、AKT1、MAPK富集于多條分子通路，亦反映關(guān)鍵靶點和分子通路在血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵性作用，如6個關(guān)鍵靶點富集于PI3K-Akt(磷酸肌醇-3羥激酶/蛋白激酶B)信號通路，5個關(guān)鍵靶點富集于HIF-1(缺氧誘導(dǎo)因子1)信號通路，5個關(guān)鍵靶點富集于MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路，F(xiàn)oxO和TNF通路有4個關(guān)鍵靶點被富集。整個富集中，PI3K-Ak信號通路、MAPK信號通路、FoxO和TNF通路被富集的蛋白最多，這均可說明這些通路在血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的過程中起到關(guān)鍵性作用。

Akt 是PI3K 信號傳導(dǎo)途徑中一個重要的下游靶激酶，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和遷移作用。PI3K/Akt信號通路在神經(jīng)組織中廣泛存在，比如腦組織海馬，其PI3K和Akt靶點酶的活化可促進內(nèi)皮細(xì)胞生存、減輕神經(jīng)元的損傷[16-17]，減少炎癥細(xì)胞的死亡[18-19]、阻擋神經(jīng)元凋亡[20-21]；血管性認(rèn)知功能障礙與許多腦血管疾病有關(guān)，大多數(shù)患者表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶力減退，嚴(yán)重者出現(xiàn)智能障礙和無法自理，其智能障礙呈現(xiàn)進行性發(fā)展趨勢[22]。研究顯示[23]：PI3K/Akt 信號通路存在于各種神經(jīng)細(xì)胞中，通過激活PI3K/Akt 信號通路[24]及提高PI3K、Akt、HIF-1α以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白和基因表達，從而修復(fù)及保護神經(jīng)元、發(fā)揮神經(jīng)保護作用、調(diào)節(jié)血管舒縮功能[25]、改善腦循環(huán)、改善腦組織海馬神經(jīng)元突觸可塑形態(tài)[26]、改善腦海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，說明PI3K/Akt通路在神經(jīng)退行性疾病及腦血管疾病等中發(fā)揮重要作用。此外，PI3K/Akt通路的激活可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元及各膠質(zhì)細(xì)胞的活性、凋亡及自噬來發(fā)揮神經(jīng)保護效應(yīng)[27-28]及調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶功能[25]。葛根素和黃芪均能通過激活PI3K/Akt通路減少大鼠腦缺血再灌注引起神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，起到神經(jīng)保護作用[29-30]。中藥復(fù)方補陽還五湯及中藥單體化合物(地黃屬、魚草屬、車前屬等)通過促進腦皮層腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，激活PI3K/Akt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，從而抑制腦組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、改善血管血流量及能量、促進神經(jīng)修復(fù)及保護作用，進而保護腦組織及改善認(rèn)知功能[31]。與之相關(guān)的TNF、EGFR、MAPK等主要及關(guān)鍵基因，在血管性認(rèn)知功能障礙的相關(guān)分子通路中起到相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，改善認(rèn)知功能障礙的相應(yīng)臨床表現(xiàn)，為后期的臨床研究及基礎(chǔ)研究提供更深入的研究方向及靶點。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的潛在靶點預(yù)測及研究其分子機制，從多成分、多靶點及多通路等系統(tǒng)層面揭示血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的作用機制，為臨床及基礎(chǔ)研究血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙的作用成分、關(guān)鍵靶點及其相關(guān)機制奠定基礎(chǔ)。下一步，我們將對預(yù)測的關(guān)鍵靶標(biāo)和關(guān)鍵通路進行藥理學(xué)驗證，為進一步研究血府逐瘀湯治療血管性認(rèn)知功能障礙提供依據(jù)。