沉默Orai1通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制急性腦梗死大鼠海馬神經(jīng)元凋亡①

李 航 熊 波 文遠(yuǎn)超 張 剛

（遵義市第一人民醫(yī)院，遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，遵義563000）

腦梗死（cerebral infarction，CI）又稱缺血性卒中（cerebral ischemic stroke，CIS），是導(dǎo)致老齡人群致殘和死亡的重要原因。一旦發(fā)生缺血，數(shù)小時(shí)甚至數(shù)分鐘內(nèi)就會(huì)發(fā)生序慣性腦損傷，使細(xì)胞內(nèi)外能量代謝平衡被打破，相關(guān)區(qū)域的血管單元功能受到影響，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞被損害。有研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是Ca2+在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所，腦缺血后短時(shí)間內(nèi)會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理功能紊亂，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［1-2］。ERS發(fā)生時(shí)原本存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+大量轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿，在此過(guò)程中會(huì)使鈣依賴相關(guān)的降解酶被激活而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，最終造成細(xì)胞凋亡的發(fā)生［3］。有研究表明，鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1（calcium release-activated calcium modulator 1，Orai1）缺失介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流障礙對(duì)急性CIS有神經(jīng)保護(hù)作用，但其具體機(jī)制不詳［4］。同時(shí)也有研究表明，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，STIM1和Orai1蛋白分別分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜上，但當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)耗竭時(shí)，二者在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上形成功能性鈣離子釋放激活鈣通道（Ca2+release-activated calcium chan?nel，CRAC），促使細(xì)胞外內(nèi)流Ca2+，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［5］。本研究擬通過(guò)注射Orai1干擾慢病毒下調(diào)急性CI大鼠腦缺血區(qū)組織中Orai1基因表達(dá)，觀察其對(duì)腦神經(jīng)功能的保護(hù)作用，探討其可能作用機(jī)制，為心腦血管疾病防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD大鼠60只，鼠齡6～7周，體重（220±20）g，由湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（鄂）2018-0031。溫度為24℃，濕度為50%，通風(fēng)良好，明暗光照交替12 h，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，貨號(hào)T8877）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、Furo-3/AM、BCA試劑盒和TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Orai1、間質(zhì)相互作用分子1（STIM1）、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、同源蛋白（CHOP）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、肌醇酶-1（IRE-1）、Caspase-12和GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔或小鼠IgG抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Orai1慢病毒shRNA干擾質(zhì)粒載體、陰性對(duì)照慢病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建以及慢病毒包裝、濃縮和純化均由漢恒生物科技（上海）有限公司完成，shRNA-Orai1特異性序列為F：5′-AGAAACACACTCTTTGGCAdTdT-3′；R：5′-AATGCT?GTCACCTCGCdTdT-3′。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建與分組處理 60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組，即假手術(shù)組（sham）、模型組（model）、Orai1干擾組（shRNAOrai1）、陰性對(duì)照組（shRNA-NC），15只/組。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，采用改良Longa線栓法制作急性CI大鼠模型［6］。術(shù)前24 h，shRNA-Orai1組和shRNA-NC組大鼠采用立體定位經(jīng)側(cè)腦室（前囟后1 mm，旁開(kāi)1.5 mm，深3.5 mm）分別注射0.2 ml Orai1 shRNA干擾慢病毒（shRNA-Orai1）溶液及其陰性對(duì)照慢病毒（shRNA-NC）溶液，注射過(guò)程中保持緩慢、勻速并及時(shí)關(guān)注大鼠呼吸節(jié)律以避免產(chǎn)生腦疝，慢病毒滴度為2×108TU/ml，sham組和model組大鼠分別注射等量生理鹽水。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 各組大鼠于造模24 h后，采用Zea-Longa五級(jí)評(píng)分法評(píng)估神經(jīng)功能［7］，評(píng)分越高代表神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，狀態(tài)正常；1分，輕度神經(jīng)功能缺失，不能完全伸展左前肢；2分，中度神經(jīng)功能缺失，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，中度神經(jīng)功能缺失，向左側(cè)傾倒；4分，無(wú)意識(shí)，不能自發(fā)行走。

1.2.3 TTC法評(píng)估大鼠腦梗死面積 造模24 h后，在每組隨機(jī)挑選5只大鼠處死并取腦，剔除小腦和低位腦干后迅速放入-20℃冰箱，20 min后取出并切片，保持切片厚度為2～3μm，隨后使用2%TTC液染色，37℃避光染色25 min后可觀察到梗死區(qū)域呈白色。拍照并使用ImagePro Plus 6圖像分析軟件計(jì)算CI百分比。CI面積百分比（%）=CI組織總面積/腦組織面積×100%。

1.2.4 熒光探針?lè)z測(cè)大鼠海馬組織內(nèi)Ca2+濃度 造模24 h后，斷頭處死，取腦并分離出海馬，將海馬剪成漿狀后使用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，然后用Furo-3/AM熒光探針（4 mol/L）負(fù)載45 min，最后使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度［8］。

1.2.5 TUNEL染色檢測(cè)大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡 造模24 h后，斷頭處死取腦，剝離大鼠大腦并分離出海馬組織，洗凈后用10%甲醛固定24 h后脫水處理，常規(guī)石蠟包埋，制作3～4μm石蠟切片，采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TU?NEL）標(biāo)記凋亡的神經(jīng)元。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元呈線型緊密有序排列，且細(xì)胞核明顯，細(xì)胞體積偏大，顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)。神經(jīng)細(xì)胞凋亡率（%）=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)大鼠海馬組織中Orai1的mRNA表達(dá) 收集各組大鼠海馬組織，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣本總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cD?NA，并以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。Orai1引物序列，F(xiàn)：5′-TGGCCGTGCACCTGTTC-3′，R：5′-TTGCTCACAGCCTCGATGTT-3′；GAPDH引 物 序列，F(xiàn)：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，R：5′-CCACAGTCCGCCATCACT-3′。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Orai1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測(cè)大鼠海馬組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組大鼠海馬組織，加入適量RIPA裂解液，冰上充分裂解30 min，4℃條件下12 000 r/min離心20 min，收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入一抗稀釋液（Orai1、STIM1、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、CHOP、GRP78、IRE-1、Caspase-12、GAPDH，1：1 000），4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或小鼠IgG（1：20 000），室溫孵育1 h，洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，于暗室顯影分析。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 如圖1所示，與sham組相比，model組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分升高（P＜0.01）；與model組和shRNA-NC組相比，shRNAOrai1組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.01）。

2.2 各組大鼠CI面積 如圖2所示，sham組大鼠無(wú)CI面積，其他各組大鼠均出現(xiàn)CI面積。與model組和shRNA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠CI面積比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠海馬組織Ca2+濃度 如圖3所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織中Ca2+濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與model組和shR?NA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠海馬組織中Ca2+濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較Fig.1 Comparison of neurological scores in each group

圖2 各組大鼠腦梗死面積比較Fig.2 Comparison of brain infarct area in each group

圖3 各組大鼠海馬組織Ca2+濃度比較Fig.3 Comparison of Ca2+concentration in hippocampal tissues of rats in each group

2.4 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡水平 如圖4、5所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率及凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Bax表達(dá)水平均升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與model組和shRNA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率及Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 各組大鼠海馬組織中Orai1 mRNA及其蛋白表達(dá) 如圖6所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織中Orai1 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與model組和shRNA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠海馬組織中Orai1 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.6 各組大鼠海馬組織中STIM1蛋白表達(dá) 如圖7所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織中STIM1蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與model組和shRNA-NC組相比，shRNAOrai1組大鼠海馬組織中STIM1蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.7 各組大鼠海馬組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、GRP78、IRE-1和Caspase-12表達(dá) 如圖8所示，與sham組相比，model組大鼠海馬組織中CHOP、GRP78、IRE-1和Caspase-12蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與model組和shR?NA-NC組相比，shRNA-Orai1組大鼠海馬組織中CHOP、GRP78、IRE-1和Caspase-12蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 TUNEL染色（×200）Fig.4 TUNEL staining（×200）

圖5 各組大鼠海馬組織中凋亡蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of apoptotic proteins expression in hip?pocampal tissue of rats in each group

圖6 各組大鼠海馬組織中Orai1基因表達(dá)比較Fig.6 Comparison of Orai1 gene expression in hippocam?pal tissue of rats in each group

圖7 各組大鼠海馬組織中STIM 1蛋白表達(dá)比較Fig.7 Comparison of STIM 1 protein expression in hippo?campal tissue of rats in each group

圖8 各組大鼠海馬組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig.8 Comparison of endoplasmic reticulum stress-relat?ed proteins expression in hippocampal tissue of rats in each group

3 討論

CIS后缺血半暗帶神經(jīng)元的保護(hù)及功能恢復(fù)，是臨床治療的重要靶標(biāo)，也是決定臨床預(yù)后的重要因素。無(wú)論是藥物還是手術(shù)處理，實(shí)現(xiàn)局部血管再通、血流恢復(fù)，均有可能引起缺血半暗帶的再灌注損傷，嚴(yán)重者可進(jìn)一步加重神經(jīng)功能障礙。既往研究提示，氧化應(yīng)激、鈣超載及興奮性毒性等因素均參與其中［9-10］。Ca2+是神經(jīng)元最普遍的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，而鈣超載是腦缺血后導(dǎo)致細(xì)胞損傷最重要的一類離子失衡，Orai1通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流障礙對(duì)急性CIS有神經(jīng)保護(hù)作用［11］。本研究通過(guò)改良Longa線栓法制作急性CI大鼠模型，并干預(yù)腦組織中Orai1基因表達(dá)，結(jié)果顯示：干擾Orai1可明顯降低CI大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分、CI面積及海馬組織神經(jīng)元凋亡率，同時(shí)上調(diào)海馬組織中Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達(dá)，說(shuō)明抑制Orai1基因表達(dá)可有效減輕急性CI大鼠神經(jīng)損傷，具有腦保護(hù)作用。

Ca2+作為信使參與多種神經(jīng)細(xì)胞功能活動(dòng)的調(diào)節(jié)，而Ca2+超載是腦缺血后導(dǎo)致細(xì)胞損傷中最重要的一類離子失衡。當(dāng)各類刺激發(fā)生時(shí)，會(huì)使海馬神經(jīng)細(xì)胞中的Ca2+大量?jī)?nèi)流，造成細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載，而Ca2+失衡會(huì)引發(fā)蛋白激酶C的持續(xù)激活，同時(shí)其持續(xù)激活會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，加重Ca2+超載，這兩個(gè)過(guò)程循環(huán)往復(fù)使得蛋白酶和核酸內(nèi)切酶的活化及合成過(guò)程被促進(jìn)，最后導(dǎo)致神經(jīng)元功能結(jié)構(gòu)的損害及細(xì)胞的凋亡［12-13］。有研究顯示，缺血后Ca2+內(nèi)流是導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的主要原因［14］。本研究結(jié)果也顯示，模型組大鼠海馬內(nèi)Ca2+濃度明顯升高，而Orai1干擾組大鼠海馬內(nèi)Ca2+濃度明顯降低，說(shuō)明腦缺血大鼠模型中海馬組織高表達(dá)的Orai1可誘導(dǎo)Ca2+大量?jī)?nèi)流造成神經(jīng)元凋亡，而抑制Orai1表達(dá)可阻斷神經(jīng)元凋亡的相關(guān)下游機(jī)制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是Ca2+在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣通道被外源性化合物誘導(dǎo)而發(fā)生改變時(shí)就會(huì)出現(xiàn)Ca2+超載或Ca2+耗竭現(xiàn)象，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理功能紊亂，從而影響蛋白的合成、折疊及修飾過(guò)程，最終導(dǎo)致ERS的發(fā)生，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡［15］。有研究表明，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，STIM1和Orai1蛋白分別分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜上，但當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)耗竭時(shí)，二者在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上形成功能性CRAC，促使細(xì)胞外內(nèi)流Ca2+，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起ERS并介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［5］。待細(xì)胞內(nèi)鈣恢復(fù)后，STIM1-Orai1復(fù)合體穩(wěn)定性逐漸下降，STIM1蛋白多聚體解聚，逐漸恢復(fù)至靜息狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織內(nèi)STIM1和Orai1蛋白表達(dá)顯著增多，與模型組相比，Orai1干擾組大鼠海馬組織內(nèi)STIM1和Orai1蛋白表達(dá)顯著減少。說(shuō)明Orai1介導(dǎo)鈣內(nèi)流，抑制Orai1可對(duì)腦缺血后神經(jīng)元起保護(hù)作用，STIM1和Orai1蛋白可能是神經(jīng)系統(tǒng)疾病替代療法的新靶點(diǎn)。

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的一種分子伴侶，是公認(rèn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白［5］。正常情況下與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的活化轉(zhuǎn)錄因子6、肌醇激酶1（inositol-re?quiring kinase-1，IRE-1）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR-like ER kinase，PERK）處于緊密結(jié)合狀態(tài)，都沒(méi)有活性。但當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，GRP78會(huì)從這3種跨膜蛋白上解離出來(lái)，與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白結(jié)合，恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確結(jié)構(gòu)，使相關(guān)蛋白質(zhì)能夠正確合成，從而保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡穩(wěn)定，故GRP78的表達(dá)水平在一定程度上反映了細(xì)胞ERS保護(hù)性反應(yīng)的程度［16］?；罨腜ERK和IRE-1可通過(guò)激活TRAF2蛋白進(jìn)一步活化Caspase-12，而后活化的Caspase-12易位至細(xì)胞質(zhì)，剪切Caspase-9前體產(chǎn)生活化的Cas?pase-9，進(jìn)而激活下游凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。CHOP也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白，在非ERS狀態(tài)時(shí)，CHOP主要存在于細(xì)胞質(zhì)，含量很低，在細(xì)胞發(fā)生ERS時(shí)，CHOP活化并高表達(dá)后轉(zhuǎn)移至線粒體，通過(guò)線粒體途徑使抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)被抑制，而促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)被促進(jìn)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生［18-19］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、GRP78、IRE-1和Caspase-12蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，與模型組比較，Orai1干擾組大鼠海馬組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。提示急性CI能夠直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)異常，誘發(fā)ERS，進(jìn)而加劇胞漿Ca2+超載，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，下調(diào)Orai1基因表達(dá)可改善急性CI大鼠神經(jīng)功能，減少CI面積和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與平衡海馬內(nèi)Ca2+的濃度，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。