蛋白激酶C 在機(jī)械牽張致肺上皮細(xì)胞損傷中的作用＊

劉孟潔，谷長平，王月蘭

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）、急性呼吸窘迫綜合征 （acute respiratory distress syndrome，ARDS） 是由各種非心源性原因?qū)е碌姆蚊?xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞損傷，血管通透性增高的臨床綜合征，表現(xiàn)為急性、進(jìn)行性加重的呼吸困難，難治性低氧血癥和肺水腫［1］。 ALI 和ARDS 是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的復(fù)雜的臨床綜合征，是嚴(yán)重?fù)p傷引起機(jī)體全身免疫炎癥反應(yīng)失控過程中的不同階段。

機(jī)械通氣誘發(fā)肺損傷（ventilation induced lung injury，VILI） 的基本機(jī)制為肺組織過度牽拉的機(jī)械因素和機(jī)械力學(xué)誘導(dǎo)的肺臟局部細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放［2］，肺泡膜的完整性破壞及通透性增加是根本原因。 細(xì)胞連接蛋白是維持黏膜上皮機(jī)械屏障和通透性的重要結(jié)構(gòu)，主要包括Zo-1、Claudin 和Occludin 蛋 白 等［3］，其 中occludin 是 最 早 被 發(fā) 現(xiàn) 的組成緊密連接（tight junction，TJ）最主要的成分。 蛋白激酶C（PKC）是一種磷脂依賴的絲/蘇氨酸激酶，有研究表明在occludin 蛋白功能的調(diào)節(jié)中，絲/蘇氨酸的磷酸化狀態(tài)較為重要。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12（上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫），F(xiàn)lexcell 細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)FX-5000TM 及BioFLEX○R雙向應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)板（Flexcell公司， 美國）， 兔抗大鼠Occludin 多克隆抗體、DMEM/F12 胎牛血清（Invitrogen 公司，美國），蛋白激酶C（PKC）抑制劑BisindolylmaleimideⅠ（批號：133052-90-1，Cayman 公司，美國），二甲基亞砜（批號：0231，Amresco 公司，美國），二氧化碳培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，Tanon-4500SF 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)由山東省千佛山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心提供。

MLE-12 細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，傳代至穩(wěn)定。 牽張前將MLE-12 細(xì)胞以1×105個(gè)/cm2的密度接種到Bio FLEX 彈性膜細(xì)胞培養(yǎng)板靜置培養(yǎng)24～48 h， 再使用無血清培養(yǎng)基饑餓處理2 h。 機(jī)械牽張組采用Flexcell 5000TM 牽張細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［4］的方法，將Bio FLEX 培養(yǎng)板放入牽張儀，壓緊保證其密閉，分別施加不同牽張力使彈性膜拉伸8%和20%，牽張頻率0.5 Hz，牽張時(shí)間分別為0 h、1 h、2 h、4 h； 之后再將MLE-12 細(xì)胞隨機(jī)分為3 組：牽張組（C 組）、二甲基亞砜對照組（D 組）和PKC 抑制劑BIM 組（B 組），牽張前1 h；D 組和B組分別加入二甲基亞砜）30 μl/ml 和PKC 抑制劑BisindolylmaleimideⅠ5 μmol/L（用二甲基亞砜溶解）處理細(xì)胞，采用20%的強(qiáng)度牽張4 h，頻率0.5 Hz。牽張完成后將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察拍照。 之后取出Bio FLEX 培養(yǎng)板，PBS 沖洗，胰酶消化后離心取沉淀， 加充分裂解后，12000×g 離心5 min 取上清，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒對肺組織上清定量，加樣于10%SDS-PAGE 進(jìn)行電泳（80 V，30 min；120 V，60 min），濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜（280 mA，60 min），5%的脫脂奶粉37 ℃封閉60 min，分別加入Occludin多克隆抗體（1∶250）和內(nèi)參GAPDH 一抗（1∶3000），4 ℃孵育過夜， 洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的二抗 （1∶5000）37 ℃雜交60 min，洗膜后用ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測陽性信號，Tanon-4500SF 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)觀察，用軟件對圖像條帶進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算積分吸光度值。 以積分吸光度值反映肺組織occludin 蛋白的表達(dá)水平。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肺上皮細(xì)胞不同牽張時(shí)間點(diǎn)occludin 蛋白的表達(dá) 機(jī)械牽張導(dǎo)致小鼠肺上皮細(xì)胞表面的細(xì)胞連接蛋白o(hù)ccludin 的表達(dá)減少，呈時(shí)間和強(qiáng)度依賴性。 在機(jī)械牽張不同時(shí)間0 h、1 h、2 h、4 h，牽張強(qiáng)度8%occludin 蛋白表達(dá)為0.934±0.011、0.711±0.063、0.644±0.037、0.539±0.016， 牽張強(qiáng)度20%occludin 蛋白表達(dá)為0.913±0.008、0.692±0.048、0.571±0.039、0.307±0.066；可見，隨著時(shí)間的延長，occludin 蛋白表達(dá)逐漸減少，20%的牽張強(qiáng)度牽張4 h 時(shí)occludin 蛋白減少最明顯。

2.2 3 組MLE-12 細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)0ccludin 蛋白表達(dá)比較 3 組細(xì)胞隨機(jī)械牽張時(shí)間的延長，occludin蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)（P<0.05）；與C 組比較，D 組各時(shí)點(diǎn)occludin 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），B 組機(jī)械牽張2 h、4 h 時(shí)occludin 蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05），見表1。

2.3 20%牽張強(qiáng)度牽張4 h 后小鼠肺上皮MLE-12 細(xì)胞的形態(tài)改變 牽張前對照組的細(xì)胞形態(tài)正常， 成橢圓形貼壁生長， 細(xì)胞連接較緊密， 而以20%的牽張強(qiáng)度牽張4 h 后（C 組、D 組）觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈分支狀、桿狀，細(xì)胞有較多脫落，貼壁不緊，細(xì)胞間連接不夠緊密，此時(shí)的肺損傷也最嚴(yán)重， 使用BIM 處理后細(xì)胞損傷減輕（B組），見圖1。

表1 3 組MLE-12 細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)occludin 蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

表1 3 組MLE-12 細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)occludin 蛋白表達(dá)比較（n=3，±s）

注：與0 h 比較，＊P＜0.05；與1 h 比較，#P＜0.05；與2 h 比較，△P＜0.05；與C 組比較，▲P<0.05。

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圖1 3 組周期性牽張4 h 后小鼠肺上皮MLE-12 細(xì)胞的形態(tài)改變（光鏡，×400）

3 討 論

機(jī)械通氣誘發(fā)肺損傷（ventilation induced lung injury，VILI） 是指應(yīng)用呼吸機(jī)過程中由于機(jī)械通氣諸多因素和肺部原發(fā)病共同作用導(dǎo)致的肺組織損傷。 以往對機(jī)械通氣的研究主要集中在吸入高濃度氧氣的毒性效應(yīng)上。 但是近期的實(shí)驗(yàn)研究顯示，高容量和高壓力機(jī)械通氣亦可造成肺損傷，導(dǎo)致非損傷肺區(qū)發(fā)生高通透性肺水腫而已損傷肺區(qū)的水腫加重［5］。 肺泡膜的完整性破壞及通透性的增加是各種原因?qū)е碌募毙苑螕p傷肺水腫形成的根本原因。機(jī)械通氣誘發(fā)肺損傷在臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸窘迫和頑固性低氧血癥， 進(jìn)而誘發(fā)多器官功能障礙，導(dǎo)致患者死亡。VILI 的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，至今沒有統(tǒng)一定論，而筆者在之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中探討了VILI 的發(fā)病機(jī)制［6］，因此該實(shí)驗(yàn)通過對小鼠肺上皮細(xì)胞（MLE-12 細(xì)胞）進(jìn)行機(jī)械牽張模擬臨床呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，研究機(jī)械牽張過程中細(xì)胞連接蛋白o(hù)ccludin 的表達(dá)變化， 從而明確occludin 蛋白及蛋白激酶C（PKC）在機(jī)械通氣誘發(fā)肺損傷中的作用。

Occludin 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的定位于緊密連接的跨膜蛋白，而緊密連接位于上皮細(xì)胞頂端相鄰細(xì)胞間，在維護(hù)上皮細(xì)胞兩側(cè)物質(zhì)的差異和保持細(xì)胞極性以及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定上起著重要作用［3］。 Occludin蛋白作為緊密連接蛋白的重要組成成分，在維持肺泡黏膜上皮機(jī)械屏障的完整性與細(xì)胞通透性方面起著重要作用［7］。該研究結(jié)果表明，機(jī)械牽張小鼠肺上皮MLE-12 細(xì)胞，occludin 蛋白的表達(dá)減少呈時(shí)間和強(qiáng)度依賴性， 分別使用8%和20%的牽張強(qiáng)度對MLE-12 細(xì)胞進(jìn)行周期性牽張，occludin 蛋白有不同程度的表達(dá)減少，20%的牽張強(qiáng)度occludin 蛋白明顯減少；且隨著牽張時(shí)間的延長表達(dá)減少更明顯，20%牽張4 h 組occludin 蛋白減少程度最明顯，且肺損傷表現(xiàn)更嚴(yán)重。 顯微鏡下發(fā)現(xiàn)MLE-12 細(xì)胞水腫，形態(tài)不規(guī)則，呈分支狀、桿狀，細(xì)胞有較多脫落，貼壁不緊，細(xì)胞間連接不夠緊密，間隙增加。

有研究表明黏附連接蛋白p120 的減少也會(huì)導(dǎo)致肺水腫肺損傷的加重，其機(jī)制可能是機(jī)械通氣過程中激活了蛋白激酶Src［9］，而之前的研究發(fā)現(xiàn)PKC可能通過下調(diào)occludin 的表達(dá)而參與機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷的發(fā)生［10，11］，因此筆者使用PKC 抑制劑BIM 預(yù)處理牽張的細(xì)胞，以研究在周期性牽張過程中PKC 對occludin 蛋白的影響以及occludin 蛋白的表達(dá)改變對肺損傷的影響。蛋白激酶C 是一族依賴于Ca2+、磷脂或二酰甘油刺激而激活，催化絲/蘇氨酸殘基磷酸化的蛋白激酶， 廣泛分布于多種組織、器官和細(xì)胞，BIM 是一種高選擇性、膜通透的、可逆的PKC 抑制劑［12］。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，20%的強(qiáng)度周期性牽張MLE-12 細(xì)胞4 h 后，occludin 蛋白表達(dá)明顯減少， 而BIM 預(yù)處理阻斷PKC 后，occludin 蛋白表達(dá)上調(diào)，肺損傷減輕，提示周期性機(jī)械牽張激活PKC 下調(diào)occludin 的表達(dá)，從而使肺泡之間的致密連接受損，引起肺泡膜的完整性破壞和通透性的增加，導(dǎo)致急性肺水腫，表明由于蛋白激酶的激活導(dǎo)致的occludin 的表達(dá)下調(diào)了參與大鼠機(jī)械通氣肺損傷的病理生理過程。

綜上所述， 機(jī)械牽張可下調(diào)小鼠肺上皮細(xì)胞occludin 蛋白表達(dá)， 呈時(shí)間依賴性及強(qiáng)度依賴性，PKC 抑制劑減輕occludin 的下調(diào)從而緩解肺損傷，因此認(rèn)為蛋白激酶C 可能參與機(jī)械通氣誘發(fā)肺損傷的發(fā)生。