UCP2在COPD患者中的表達(dá)及與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性研究①

趙晨旭，楊曉東，馬雪梅，鮑文華

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，黑龍江 佳木斯 154003)

解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)是廣泛分布于人類及嚙齒類動(dòng)物脂肪、肺、腦、胃腸道、脾和胰腺等器官組織線粒體內(nèi)膜上的陽(yáng)離子載體蛋白，其具有將線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、保護(hù)組織器官免受氧化損傷等作用[1]。近年來(lái)，UCP2與呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)系逐步受到關(guān)注，已經(jīng)有研究表明UCP2參與肺癌、肺動(dòng)脈高壓、急性肺損傷等多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持續(xù)氣流受限為特征的肺部慢性疾病，其發(fā)病機(jī)尚不完全明確，目前已知與炎癥機(jī)制、氧化應(yīng)激、蛋白/抗蛋白酶失衡、免疫功能異常等有關(guān)。進(jìn)一步研究COPD的發(fā)病機(jī)制對(duì)控制疾病的進(jìn)展及改善預(yù)后至關(guān)重要，故本文對(duì)UCP2在COPD患者中的表達(dá)及其與T淋巴細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，分析UCP2在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)組選擇2019-05～2020-04在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院治療的COPD急性加重期患者，所有患者均符合2019年GOLD指南中COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，患者表現(xiàn)為咳嗽、咳痰，呼吸困難加重者設(shè)為急性加重期組，共60例；前組患者經(jīng)治療臨床癥狀緩解，恢復(fù)到本次發(fā)病前狀態(tài)，設(shè)為穩(wěn)定期組，共60例。對(duì)照組選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)期正常體檢健康成年人30例。COPD患者組和健康對(duì)照組年齡分別為(68.17±5.43)歲、(63.86±7.95)歲，其中COPD組男33例、女27例； 健康對(duì)照組中，男16例，女14例。年齡、性別構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)院倫理委員會(huì)審查、批準(zhǔn)通過(guò)后實(shí)施。每一位受試者對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?nèi)容等知情并同意后入選。

1.2 藥品及試劑

人解偶聯(lián)蛋白酶2(UCP2)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于上海信帆生物科技有限公司；鼠抗人免疫熒光染色CD3+FITC/CD4+PE、CD3+PE/CD8+FITC單克隆抗體及FACS紅細(xì)胞溶血?jiǎng)┘t細(xì)胞裂解液均購(gòu)自美國(guó)BD(Becton Dickinson)公司；人外周淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

COPD急性加重期組、COPD穩(wěn)定期組和健康對(duì)照組分別于入院后首日晨、出院前一日晨和體檢當(dāng)日晨行肺功能、血?dú)馑胶脱獫{UCP2水平、外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+(%)、CD8+(%)及CD4+/CD8+比值檢測(cè)。

1.3.1 肺功能檢測(cè): 采用德國(guó)Jaeger ms-los digital肺功能檢測(cè)儀常規(guī)檢測(cè)FVC(Al/Pd %)、FEV1(Al/Pd %)、FEV1/FVC(Al %)，以3次測(cè)定值中最高值作為最終肺功能測(cè)定值。

1.3.2 血?dú)夥治? 安靜、呼吸穩(wěn)定狀態(tài)下，不吸氧狀態(tài)或標(biāo)注吸氧濃度，股動(dòng)脈或橈動(dòng)脈采血，立即采用德國(guó)西門子CA164型血?dú)夥治鰞x檢測(cè)氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)。

1.3.3 血漿UCP2水平檢測(cè): 空腹抽取肘靜脈血2mL，置于二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，混勻后2h內(nèi)4℃離心分離血漿(3000r/min，15min)置于-80℃冰箱中保存。按照人解偶聯(lián)蛋白酶2(UCP2)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，采用美國(guó)BioTektronix公司Epoch2微孔板酶標(biāo)儀型酶標(biāo)儀進(jìn)行血漿UCP2水平檢測(cè)。

1.3.4 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 空腹肘靜脈采血2mL，應(yīng)用美國(guó)BD公司FACS Calibur 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，使用Simu1SET型軟件分析結(jié)果，報(bào)告CD4+(%)、CD8+(%)，計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 COPD患者肺功能及血?dú)庵笜?biāo)的變化

COPD各組FEV1(Al/Pd %)、FEV1/FVC(Al %)、PaO2(mmHg)明顯低于健康對(duì)照組(P<0.01)，穩(wěn)定期組FEV1(Al/Pd %)、FEV1/FVC(Al %)、PaO2(mmHg)明顯高于急性加重期組(P<0.01)。COPD各組PaCO2(mmHg) 明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01)，穩(wěn)定期組明顯低于急性加重期組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 3組COPD患者肺功能、血?dú)獾淖兓?/p>

2.2 COPD患者外周血T淋巴細(xì)胞CD4+(%)、CD8+(%)、CD4+/CD8+、UCP2水平的變化

COPD各組外周血CD4+(%)、CD4+/CD8+比值明顯低于健康對(duì)照組(P<0.01)，穩(wěn)定期組明顯高于急性加重期組(P<0.01)；COPD各組CD8+(%)、血漿UCP2明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01、P<0.05)，穩(wěn)定期組明顯低于急性加重期組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 COPD患者外周血UCP2水平、CD4+(%)、CD8+(%)、CD4+/CD8+比值的變化

2.3 COPD患者外周血UCP2含量與FEV1(Al/Pd %)及T淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)性分析

COPD患者外周血血漿UCP2含量與FEV1(Al/Pd %)、外周血CD4+(%)及CD4+/CD8+比值均呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01)；與外周血CD8+(%)呈明顯正相關(guān)(P<0.01)見(jiàn)表3。

表3 COPD患者外周血血漿UCP2含量與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析

3 討論

COPD發(fā)病率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)，目前20歲及以上人群COPD的總體患病率為8.6%，40歲及以上人群為13.7%[2]。世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)到2020年因COPD致死人數(shù)將位居全球第三，成為位于世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)第五位的疾病。COPD是以持續(xù)氣流受限為特征的慢性疾病，本實(shí)驗(yàn)中COPD患者均存在明顯的氣流受限以及血?dú)庵笜?biāo)改變，且以急性加重期最著，經(jīng)過(guò)治療后肺功和血?dú)庵笜?biāo)能得以改善，符合FEV1反映氣流受限程度且與COPD進(jìn)展的嚴(yán)重程度相關(guān)的結(jié)果，再次證明FEV1是判斷患者預(yù)后的最佳指標(biāo)之一。

COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)仍不能完全明確。有研究指出免疫機(jī)制和細(xì)胞因子失調(diào)共同參與COPD的發(fā)生發(fā)展，其中又以表達(dá)于CD4+的輔助細(xì)胞(TH)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)失衡尤為突出[3,4]。已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)COPD患者外周血CD4+細(xì)胞、CD4+/CD8+比值較正常對(duì)照組減少，CD8+細(xì)胞較對(duì)照組增加，反映機(jī)體免疫調(diào)節(jié)失衡，且與疾病進(jìn)展程度相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。此外，T淋巴細(xì)胞亞群的改變還與FEV1%預(yù)計(jì)值、FEV1/FVC%具有相關(guān)性，這可能由于T淋巴細(xì)胞減少使其對(duì)Th1、Th17的抑制作用降低，致機(jī)體高免疫應(yīng)答，氣道及肺組織受損引起肺功能下降[5]。COPD的發(fā)病機(jī)制中存在自身免疫反應(yīng)的參與。UCP2作為一種線粒體內(nèi)膜質(zhì)子載體蛋白，具有減少胰島素分泌、調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、抗神經(jīng)元凋亡等功能，且目前已有多項(xiàng)研究表明UCP2可通過(guò)調(diào)控Toll樣受體4介導(dǎo)的ROS信號(hào)，激活ROS依賴的ERK和p38通路形成正反饋環(huán)路[6～8]等途徑抑制ROS生成，在改善氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮了重要作用。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)各組血漿UCP2進(jìn)行測(cè)定，COPD各組血漿UCP2明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01)，穩(wěn)定期組明顯低于急性加重期組(P<0.01)，說(shuō)明UCP2參與COPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在COPD的進(jìn)程中機(jī)體可能通過(guò)高表達(dá)UCP2 以抑制ROS生成，改善COPD患者的氧化應(yīng)激損傷，這可能是UCP2在COPD疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。已有學(xué)者對(duì)受刺激T細(xì)胞中UCP2的表達(dá)模式和上調(diào)的時(shí)間進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)UCP2參與免疫應(yīng)答[9]，本實(shí)驗(yàn)中COPD患者外周血血漿UCP2含量與外周血CD4+(%)及CD4+/CD8+比值均呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與外周血CD8+(%)呈明顯正相關(guān)(P<0.01)，說(shuō)明 COPD患者血漿UCP2與T淋巴細(xì)胞亞群存在相關(guān)性，這可能由于高表達(dá)的UCP2抑制了ROS生成，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能活動(dòng)，影響COPD的發(fā)生發(fā)展。此外，本實(shí)驗(yàn)中COPD患者外周血血漿UCP2含量與FEV1%預(yù)計(jì)值呈明顯負(fù)相關(guān)，說(shuō)明檢測(cè)UCP2含量或可作為判斷COPD患者病情、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

綜上所述，UCP2在COPD發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，檢測(cè)COPD患者血漿UCP2含量或可作為另一判斷患者病情、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的重要指標(biāo)，并為COPD的治療提供新的靶點(diǎn)。