國醫(yī)大師呂仁和教授治療糖尿病腎病核心藥物組合及作用機制研究

車 彪 邵 凡 王世東 陳小愚 李 娜 李瀟然 唐 誠

1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院腎病內(nèi)分泌2區(qū)，北京 100700；2.生命奇點科技有限公司，北京 100089

糖尿病腎病是臨床常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，據(jù)統(tǒng)計,我國30%～50%的糖尿病患者合并有糖尿病腎病[1]。國醫(yī)大師呂仁和教授師從施今墨、秦伯未、祝諶予等中醫(yī)名家，在防治糖尿病腎病方面取得了突出成就，提出了糖尿病腎病“微型癥瘕”病機及散結(jié)消聚治法。本研究通過對呂仁和教授門診治療糖尿病腎病患者病例進行數(shù)據(jù)挖掘，并結(jié)合網(wǎng)絡藥理學技術(shù)，試對呂仁和教授治療糖尿病腎病核心藥物組合及其藥理學作用機制進行研究，以揭示其科學內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集2018年1月—2019年4月于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院呂仁和教授門診就診的糖尿病腎病患者的病案。

1.2 納入標準

①符合2015年《中國成人糖尿病腎病診治的專家共識》[2]制訂的糖尿病腎病診斷標準。②患者基本信息、癥狀、處方記錄完整。③由專家親自開具處方，處方有專家簽名。

1.3 排除標準

①專家簽字處方中屬于轉(zhuǎn)抄其他醫(yī)師處方者，或非患者本人就診者。②未服用中藥湯藥治療的患者。

1.4 醫(yī)案數(shù)據(jù)庫建立及醫(yī)案數(shù)據(jù)處理

根據(jù)疾病診斷標準及納排標準，共篩選出334例糖尿病腎病患者病案。由雙人將334例次處方標準化錄入Microsoft office Excel 2016軟件，建立呂仁和教授診治糖尿病腎病醫(yī)案數(shù)據(jù)庫，并對雙錄入數(shù)據(jù)進行核查。藥物名稱參考《中華人民共和國藥典》[3]及全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《中藥學》[4]等進行中藥的標準化處理，如“赤白芍”改為“赤芍”“白芍”等。

1.5 數(shù)據(jù)挖掘

應用R軟件對334例次處方進行藥物頻數(shù)統(tǒng)計，篩選出處方中常用中藥。應用R軟件arules包中Apriori算法對334例次處方中的藥物進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設置相關(guān)參數(shù)篩選出處方中關(guān)聯(lián)性強的核心藥物組合。Apriori算法相關(guān)參數(shù)設置：最小支持度（support）為0.3，最小置信度（confidence）為0.9，最小提升度（lift）為1。

1.6 核心藥物組合作用機制分析

1.6.1 核心藥物組合化合物篩選及靶點預測 以數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果中核心藥物組合為研究對象，通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）[5]進行化合物的查詢及篩選，并查閱相關(guān)文獻資料對化合物進行補充[6-8]。選取口服利用度（oral bioavailability，OB）及類藥性（drug-likeness，DL）作為篩選指標，篩選OB≥30%且DL≥0.18的化合物作為候選化合物[9]。篩選結(jié)束后，在PubChem數(shù)據(jù)庫[10]中查詢化合物相應的SMILE號，將SMILE號導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[11]進行靶點預測。根據(jù)Unitprot數(shù)據(jù)庫[12]中相應的靶點基因名，對靶點數(shù)據(jù)進行標準化處理。

1.6.2 糖尿病腎病相關(guān)靶點篩選 以“diabetic kidney disease”“diabetic nephropathy”等為關(guān)鍵詞，篩選GeneCards數(shù)據(jù)庫[13]、TTD數(shù)據(jù)庫[14]、DrugBank數(shù)據(jù)庫[15]、Disgenet數(shù)據(jù)庫[16]中糖尿病腎病的相關(guān)靶點。對4個疾病數(shù)據(jù)庫中的靶點進行合并、去重，作為疾病的候選靶點。根據(jù)Unitprot數(shù)據(jù)庫中相應的靶點基因名，對候選靶點數(shù)據(jù)進行標準化處理。

1.6.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡及篩選關(guān)鍵靶點 對標準化后的化合物相關(guān)靶點及疾病靶點取交集，將交集靶點數(shù)據(jù)導入STRING11.0數(shù)據(jù)庫[17]中，繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖。應用Cytoscape 3.8.0軟件對所得PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析，先選取各節(jié)點連接度的2倍中位數(shù)值為最小閾值進行初次篩選，再選擇篩選后網(wǎng)絡中各節(jié)點的介度的中位數(shù)值及緊密度的中位數(shù)值為最低閾值，對靶點數(shù)據(jù)進行二次篩選。通過拓撲參數(shù)二次篩選后的靶點，其相互作用關(guān)系更緊密，傳遞的信息及影響的節(jié)點更多，為關(guān)鍵靶點。

1.6.4 富集分析 將以上所得的關(guān)鍵靶點導入Metascape平臺[18]，并進行GO功能及KEGG通路富集分析。應用R語言對富集分析中生物過程、分子功能和細胞組成成分、生物學通路4類主要數(shù)據(jù)進行可視化。

1.6.5 構(gòu)建核心藥物組合作用機制網(wǎng)絡圖 應用Cytoscape 3.8.0軟件對核心藥物組合的化合物及對應的關(guān)鍵靶點、關(guān)鍵靶點所對應的生物學通路構(gòu)建網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘

呂仁和教授334例次處方中共包含163味中藥（3769次），對其進行頻數(shù)統(tǒng)計分析，按藥物頻次由高到低進行排序，前10味依次為：丹參（294次，7.80%）、赤芍（229次，6.08%）、牡丹皮（223次，5.92%）、太子參（186次，4.94%）、豬苓（184次，4.88%）、黃芪（128次，3.40%）、川芎（126次，3.34%）、澤蘭（115次，3.05%）、茯苓（107次，2.84%）、當歸（104次，2.76%）。對163味中藥進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，根據(jù)篩選標準，共得到藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則15條（表1）。綜合頻數(shù)統(tǒng)計及關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果，丹參、赤芍、牡丹皮均出現(xiàn)在頻數(shù)統(tǒng)計及關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果前3位，為呂仁和教授治療糖尿病腎病的核心藥物組合。

表1 呂仁和教授治療糖尿病腎病藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

2.2 核心藥物組合作用機制

2.2.1 核心藥物組合化合物篩選及靶點預測結(jié)果 經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢、篩選并結(jié)合相關(guān)文獻進行數(shù)據(jù)補充，初步提取丹參化合物202種、赤芍化合物119種、牡丹皮化合物55種；根據(jù)化合物篩選要求，共篩選出化合物105種，其中丹參65種、赤芍29種、牡丹皮11種。對105種化合物進行靶點預測，共得到化合物相關(guān)靶點745個。

2.2.2 糖尿病腎病相關(guān)靶點篩選結(jié)果 從GeneCards、TTD、DrugBank、Disgenet數(shù)據(jù)庫中分別獲得糖尿病腎病相關(guān)靶點1541、13、40、64個，經(jīng)合并、去重后，共得到1581個疾病相關(guān)靶點。

2.2.3 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選結(jié)果 取化合物靶點及疾病靶點交集后，將得到的571個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫并進行PPI網(wǎng)絡構(gòu)建，結(jié)果見圖1A。經(jīng)篩選后，共得到關(guān)鍵靶點47個（表2），對其再次構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，結(jié)果見圖1B。47個關(guān)鍵靶點歸屬于67種化合物，使用中藥首字母及序號對67種化合物進行編號以利于后期分析，如MDP3表示歸屬于牡丹皮的第3個化合物；共有化合物用A及序號表示，如A1表示丹參和赤芍的共有化合物。67種化合物包括丹參48種（DS1-DS47、A1）、牡丹皮7種（MDP1-MDP4、A2-A4）、赤芍16種（CS1-CS12、A1-A4），其中包括丹參與赤芍共有化合物1種（A1）、牡丹皮與赤芍共有化合物3種（A2、A3、A4）。

圖1 潛在靶點與關(guān)鍵靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

表2 核心藥物組合關(guān)鍵靶點

2.2.4 GO及KEGG通路富集分析 為進一步闡明關(guān)鍵靶點的潛在作用機制，將47個關(guān)鍵靶點導入Metascape數(shù)據(jù)平臺進行GO及KEGG通路富集分析。經(jīng)分析，關(guān)鍵靶點涉及細胞膜筏、細胞囊腔等51個細胞組成成分，激酶結(jié)合、蛋白激酶活性等78個分子功能，細胞遷移的正向調(diào)節(jié)、激酶活性的正向調(diào)節(jié)等333個生物過程及AGE-RAGE、HIF-1138等138條信號通路，前20條信號通路見表3。使用R語言對前20條富集分析結(jié)果進行可視化，見圖2（封四）。

圖2 GO與KEGG通路富集分析氣泡圖

表3 關(guān)鍵靶點KEGG通路富集結(jié)果（前20條）

2.2.5 核心藥物組合作用機制網(wǎng)絡圖 應用Cytoscape 3.8.0軟件對丹參、赤芍、丹皮67種化合物及相對應的47個靶點，以及靶點相對應的主要通路進行分析，構(gòu)建核心藥物組合作用機制網(wǎng)絡圖，見圖3。

圖3 核心藥物組合作用機制網(wǎng)絡圖

3 討論

糖尿病腎病為臨床常見的糖尿病并發(fā)癥，發(fā)病機制復雜，病程較長，是糖尿病最常見的死因之一。目前普遍認為，持續(xù)高血糖的刺激和血流動力學的改變是導致腎損傷并加速進入糖尿病腎病末期的主要原因。糖尿病腎病發(fā)病過程中，終末期糖基化產(chǎn)物、氧化應激、多元醇通路等多種細胞活動和信號通路的激活及大量細胞因子生物活性的相互作用都參與了糖尿病腎病的發(fā)展過程[19]。

呂仁和教授認為，糖尿病以“熱傷氣陰”為基本病機，若糖尿病失治誤治，久病入絡，在氣陰兩虛甚至陰陽兩虛的基礎上，痰熱瘀郁相互膠結(jié)，瘀阻脈絡，形成“微型癥瘕”，進而損傷腎體，導致糖尿病腎病的發(fā)生[20]。丹參、牡丹皮、赤芍三味中藥在呂仁和教授處方中出現(xiàn)頻率最高，為呂仁和教授治療糖尿病腎病的核心藥物。三味藥物均可活血化瘀，入血又可涼血散血，與糖尿病腎病“熱傷氣陰”“微型癥瘕”的病機相契合。三味藥物功效類似，聯(lián)合配伍使用，則清熱化瘀之力更強。

糖尿病腎病發(fā)病機制復雜，且中藥復方成分、靶點及通路眾多，對中藥作用機制的研究較為緩慢，故丹參、赤芍、牡丹皮治療糖尿病腎病的作用機制尚未闡明。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索，本研究共篩選出105種化合物、47個化學成分與疾病共同作用靶點、333個生物過程和138個潛在信號通路，這些結(jié)果都體現(xiàn)了丹參、赤芍、牡丹皮在治療糖尿病腎病過程中多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點。

研究表明，丹參具有抗炎、改善血液流變學、減輕腎臟細胞損害、抗腎纖維化等作用[21]。丹參酮ⅡA能阻斷AGE-RAGE信號通路，改善氧化應激水平，起到減緩糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展的作用[22]。丹參酚酸可降低腎間質(zhì)纖維化大鼠血肌酐、尿素氮和羥脯氨酸水平，可能與抑制腎組織MMP-2和TIMP-2的蛋白表達，從而改善腎間質(zhì)纖維化水平有關(guān)[23]。赤芍是常用的活血化瘀中藥之一，具有抗氧化、改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛的作用[24]?，F(xiàn)代研究表明，赤芍可降低糖尿病腎病大鼠血脂、尿素氮、血肌酐水平，其作用機制可能與抑制腎臟ET-1表達，降低PKC及TGF-β1水平相關(guān)[25]。芍藥苷是赤芍的主要成分之一，Wang等[26]發(fā)現(xiàn)芍藥苷可通過上調(diào)P-PI3K和P-Akt的表達并下調(diào)P-IRS-1蛋白來改善胰島素信號缺陷。牡丹皮具有保肝、護腎、清熱、降糖、激活機體免疫系統(tǒng)等多種藥理作用[27]。Zhang等[28]研究表明，牡丹皮可顯著增加谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活性，并能下調(diào)腎組織中轉(zhuǎn)化生長因子β2蛋白的表達，即牡丹皮減弱了晚期糖化終末產(chǎn)物誘導的系膜細胞功能障礙以及高糖脂肪飲食和鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠的氧化應激反應。槲皮素是牡丹皮中的化學成分，其可以抑制多元醇通路的限速酶即醛糖還原酶的生成，從而起到延緩和防治糖尿病并發(fā)癥的作用[29]。這些與本研究篩選出的結(jié)果基本一致，提示了本研究預測的潛在作用機制的可行性，且有待后續(xù)動物或細胞試驗的驗證。