一份水稻長(zhǎng)穗突變體的鑒定及相關(guān)生理特性分析

文 歡，蔣 丹，南文斌,2，梁永書,2，張漢馬,2，秦小健,2*

(1.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331；2.重慶市植物環(huán)境適應(yīng)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401331)

【研究意義】水稻作為中國(guó)乃至世界上重要的糧食作物之一，類型豐富，具有悠久的栽培歷史[1-2]。除作為糧食外，在醫(yī)藥和工業(yè)等方面也發(fā)揮著重要作用，其穩(wěn)產(chǎn)與高產(chǎn)不僅對(duì)保證國(guó)家糧食安全具有重要意義，而且直接關(guān)系到全球社會(huì)的穩(wěn)定與發(fā)展[3-5]。在對(duì)糧食的需求量越來越大和耕地面積不斷減少的限制下，只能通過提高水稻單株產(chǎn)量來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)與高產(chǎn)從而保證糧食安全[6-7]。穗型是影響水稻增產(chǎn)的重要因素之一，因此研究長(zhǎng)穗水稻材料的生理指標(biāo)，發(fā)掘優(yōu)良的作物品種，從而為后續(xù)長(zhǎng)穗突變材料的基因定位與克隆奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為水稻增產(chǎn)研究奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在耕地面積的限制下，想要保證水稻產(chǎn)量，除了雜種優(yōu)勢(shì)，最重要的就是通過株型來提高單株產(chǎn)量。株型在水稻的品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性和光能利用率上都有著重要作用，適當(dāng)增加穗長(zhǎng)、籽粒數(shù)量和提高結(jié)實(shí)率是實(shí)現(xiàn)水稻增產(chǎn)的主要途徑[8-9]。穗部不僅與群體的結(jié)構(gòu)狀況和產(chǎn)量密切相關(guān)，是水稻高產(chǎn)育種和栽培的重點(diǎn)[10]，穗部在二氧化碳擴(kuò)散、積累光合產(chǎn)物、改善群體光照狀況以及抗逆性方面占據(jù)重要地位[11]。近年研究也發(fā)現(xiàn)穗型對(duì)水稻產(chǎn)量起著決定性作用，與穗粒數(shù)、抽穗期、穗長(zhǎng)等諸多水稻的性狀相關(guān)，而且直接決定稻穗分支的數(shù)量和長(zhǎng)度，進(jìn)而直接影響水穗的產(chǎn)量和品質(zhì)[12-14]。其中穗長(zhǎng)與穗數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與株高、生長(zhǎng)期呈顯著正相關(guān)[15]。穗長(zhǎng)影響籽粒的排列，與稻米品質(zhì)、每穗穎花數(shù)和病蟲害的發(fā)生都有很大的關(guān)系，因此開展水稻穗長(zhǎng)的研究具有重要的理論意義和實(shí)踐基礎(chǔ)[16]。隨著分子和遺傳技術(shù)的發(fā)展，對(duì)穗長(zhǎng)的研究不斷深入。誘變篩選長(zhǎng)穗突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體的株高顯著增高，穗長(zhǎng)有不同程度的增長(zhǎng)，在保留主要性狀的基礎(chǔ)上，有的性狀發(fā)生了有利變化[17]。對(duì)不同群體對(duì)數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus,QTL)的差異性以及不同環(huán)境下的水稻材料進(jìn)行研究，越來越多與水稻穗長(zhǎng)相關(guān)的QTL被定位和克隆[18-20]，已用于遺傳育種過程[21]。同時(shí)建立水稻分子輔助育種技術(shù)體系，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)尋找與粒長(zhǎng)相關(guān)的基因[22]。目前，穗型是提高水稻產(chǎn)量的重要研究?jī)?nèi)容，但有關(guān)水稻穗長(zhǎng)性狀方面的研究仍然存在很多不足，相關(guān)基因還有待進(jìn)一步挖掘和解析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究通過不同時(shí)期長(zhǎng)穗材料與常規(guī)品種9311的生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和比較分析，進(jìn)一步了解長(zhǎng)穗材料的生理生化代謝特征?！緮M解決的關(guān)鍵問題】此研究結(jié)果為后續(xù)穗長(zhǎng)相關(guān)基因的進(jìn)一步挖掘和研究奠定了基礎(chǔ)，并通過解析水稻穗長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制為后續(xù)的育種實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究實(shí)驗(yàn)材料為前期EMS誘變獲得的水稻長(zhǎng)穗突變材料和常規(guī)水稻品種9311。所有試驗(yàn)均在重慶師范大學(xué)根系發(fā)育與氮高效利用實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 相關(guān)生理生化指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 材料的獲取 長(zhǎng)穗材料與對(duì)照材料9311于2019年4月初在重慶師范大學(xué)根系發(fā)育與氮高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)田進(jìn)行播種并于5月初進(jìn)行大田移栽。在苗期對(duì)長(zhǎng)穗材料與常規(guī)水稻品種9311進(jìn)行3次重復(fù)取樣,然后進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定和分析。待其抽穗結(jié)實(shí)后以同樣方式取樣,并分析檢測(cè)其根、莖、葉的各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.2.2 農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)與分析 選取成熟后的長(zhǎng)穗材料和9311的各3株且重復(fù)3次，分別統(tǒng)計(jì)其一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、千粒重、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率等性狀。數(shù)據(jù)利用Excel和Graphpad prism5進(jìn)行相關(guān)分析。

1.2.3 SOD活性測(cè)定 用氮藍(lán)四唑(NBT)還原法測(cè)定SOD含量。將樣品在液氮中磨成漿后加入磷酸緩沖液，離心后加入NBT、甲硫氨酸溶液等進(jìn)行顯色反應(yīng)10～30 min，NBT被還原為藍(lán)色的甲腙，該物質(zhì)在560 nm處有最大吸收。

1.2.4 葉綠素含量測(cè)定 用乙醇浸提法測(cè)定葉綠素含量，將莖葉剪碎后放于離心管中加入抽提液，4 ℃避光抽提12 h，再用酶標(biāo)儀分別測(cè)定波長(zhǎng)640 和663 nm下的吸光值。

1.2.5 脯氨酸含量測(cè)定 用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量，稱取0.3 g樣品加入5 mL 3 % 磺基水楊酸溶液沸水煮10 min，吸取2 mL提取液加入2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮沸水煮30 min,冷卻加入甲苯靜置后在波長(zhǎng)為520 nm處比色，其色度與脯氨酸含量成正相關(guān)。

1.2.6 可溶性糖含量測(cè)定 用蒽酮比色法測(cè)定可溶糖含量，稱取0.3 g樣品剪碎后在沸水中煮10 min,冷卻后取2 mL加入蒽酮試劑，搖勻后沸水煮10 min，冷卻后在波長(zhǎng)為620 nm處測(cè)其吸光度，色度與可溶性糖的含量成正比。

1.2.7 可溶性蛋白含量測(cè)定 用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定可溶蛋白含量，稱取0.3 g樣品，加水研磨后離心，取1 mL溶液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250，該物質(zhì)與可溶性蛋白結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，?95 nm下有最大吸收值。

1.2.8 丙二醛含量測(cè)定 用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)法測(cè)定丙二醛含量，將樣品剪碎后加入5 mL 10 % 三氯乙酸研磨至勻漿，加入0.5 %TBA后沸水煮10 min，冷卻后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450、532、600 nm處的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理利用 Excel進(jìn)行，相關(guān)性分析和作圖采用GraphPad Prism5和CorelDRAW X4來完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)穗材料相關(guān)農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)長(zhǎng)穗材料的相關(guān)農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與常規(guī)水稻品種9311相比，發(fā)現(xiàn)其穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、二次枝梗數(shù)均有增加且達(dá)到差異顯著水平，而長(zhǎng)穗材料的千粒重與9311相比顯著性降低。另外，長(zhǎng)穗材料的結(jié)實(shí)率降低而單株產(chǎn)量方面有所增加但均為差異不顯著(圖1)。該材料作為一份優(yōu)異的水稻長(zhǎng)穗種質(zhì)資源,為后續(xù)水稻穗長(zhǎng)相關(guān)基因定位克隆提供了材料基礎(chǔ),同時(shí)為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的雜交水稻新品種提供了可能。

2.2 葉綠素含量分析

葉綠素作為光合作用反應(yīng)過程的關(guān)鍵色素分子，其含量與植物光合作用效率及氮素營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供有機(jī)物。通常在一定條件下植物的產(chǎn)量與葉綠素含量呈正比,通過植物葉綠素含量測(cè)定對(duì)了解植物生長(zhǎng)發(fā)育以及水稻育種十分重要。通過測(cè)定長(zhǎng)穗材料與9311幼苗期和成熟期兩個(gè)時(shí)期的葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)穗材料幼苗期莖和成熟莖、葉中的含量顯著高于9311，而9311幼苗期葉中的含量顯著高于長(zhǎng)穗材料，其中成熟期莖中的含量存在極顯著差異(圖2)。該結(jié)果表明隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行,尤其在生長(zhǎng)發(fā)育后期長(zhǎng)穗材料可能具有更高的光合效率。

2.3 SOD和丙二醛含量測(cè)定

SOD作為一種抗氧化酶，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起著重要的作用，而丙二醛含量可反應(yīng)植物的抗逆性。分別測(cè)定長(zhǎng)穗材料與9311幼苗期和成熟期的SOD和丙二醛(MDA)含量，分析發(fā)現(xiàn)MDA含量，9311幼苗期根和成熟期莖中的含量高于長(zhǎng)穗材料，成熟期長(zhǎng)穗材料葉中的含量明顯高于9311，其它無(wú)明顯差異，而在SOD活性方面，長(zhǎng)穗材料幼苗期根和莖中的含量顯著高于9311，成熟期9311葉中的含量顯著高于長(zhǎng)穗材料，其它無(wú)明顯差異(圖3)。從SOD和丙二醛測(cè)定的結(jié)果表明，與常規(guī)品種9311相比，長(zhǎng)穗材料在幼苗期的抗逆性可能高于9311，而隨著生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行到成熟期時(shí)其抗逆性可能相比較弱。

2.4 脯氨酸含量分析

脯氨酸作為植物蛋白的組成成分之一，其含量在一定程度上反應(yīng)了植物的抗逆性。為了進(jìn)一步分析與驗(yàn)證長(zhǎng)穗材料的抗逆特性，分別測(cè)定長(zhǎng)穗材料和9311的幼苗期和成熟期兩個(gè)時(shí)期的脯氨酸含量，發(fā)現(xiàn)幼苗期的根和莖中脯氨酸含量存在顯著差異，均為長(zhǎng)穗材料高于9311，而到成熟期時(shí)在根和葉中存在顯著差異，均為9311高于長(zhǎng)穗材料(圖4)。結(jié)果表明，在不考慮其他因素的情況下，幼苗期的長(zhǎng)穗材料抗逆性更強(qiáng)，到成熟期時(shí)其抗逆性與相比9311變?nèi)酰摻Y(jié)果與丙二醛和SOD的分析結(jié)果一致。

2.5 可溶糖與可溶蛋白含量測(cè)定

可溶糖是植物生長(zhǎng)發(fā)育和基因表達(dá)調(diào)控過程的重要調(diào)節(jié)因子，在植物的整個(gè)生長(zhǎng)周期中具有重要作用。為了解長(zhǎng)穗材料不同發(fā)育階段的可溶性糖含量，分別在幼苗期和成熟期測(cè)定長(zhǎng)穗材料與9311中的可溶性糖，結(jié)果顯示長(zhǎng)穗材料的幼苗期葉和成熟期根、葉中的可溶糖含量均顯著高于9311，而9311成熟期莖中的含量高于長(zhǎng)穗材料，其它無(wú)明顯區(qū)別(圖5-A和5-B)。另外，同時(shí)對(duì)2份材料的可溶性蛋白進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)穗材料幼苗期的根、莖、葉中均顯著低于9311，而成熟期的根中幾乎沒有檢測(cè)到可溶性蛋白，長(zhǎng)穗材料的莖部含量明顯高于9311且葉部沒有明顯區(qū)別(圖5-C和5-D)。

2.6 長(zhǎng)穗材料各生理生化指標(biāo)的相關(guān)性

為進(jìn)一步了解長(zhǎng)穗材料在幼苗期和成熟期階段各生理生化指標(biāo)的相互關(guān)系，對(duì)該材料在兩個(gè)階段不同生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，僅在長(zhǎng)穗材料的幼苗期，莖部的脯氨酸含量和可溶糖含量呈極顯著的負(fù)相關(guān)，葉部的SOD含量與脯氨酸含量也存在極顯著的負(fù)相關(guān)性，其余指標(biāo)存在的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平(表1)。另外，成熟期各相關(guān)指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性，但均未達(dá)到顯著水平(表2)。對(duì)不同部位在不同階段的各相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，深入了解長(zhǎng)穗材料在各生長(zhǎng)發(fā)育階段的生理響應(yīng)差異十分重要，同時(shí)也為后續(xù)進(jìn)一步的研究工作提供一定幫助。

表1 長(zhǎng)穗材料幼苗期生理指標(biāo)相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of physiological indexes in seedlings stage of long panicle rice

表2 長(zhǎng)穗材料成熟期生理指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of physiological indexes in mature stage of long panicle rice

3 討 論

3.1 水稻穗型與產(chǎn)量的關(guān)系

水稻作為重要的糧食作物之一，如何提高或者保障水稻的產(chǎn)量成為當(dāng)前水稻研究的重要內(nèi)容之一[23]。在對(duì)糧食需求量不斷增加情況下，提高和保證水稻產(chǎn)量是目前育種的首要任務(wù)和目標(biāo)。因此，創(chuàng)制和挖掘優(yōu)異的水稻種質(zhì)資源，同時(shí)克隆和解析水稻產(chǎn)量關(guān)鍵基因?qū)τ诒ＷC國(guó)家糧食安全有十分重要的意義。已有研究表明，水稻穗長(zhǎng)是一種受多基因控制數(shù)量性狀，易受環(huán)境的影響，同時(shí)對(duì)水稻產(chǎn)量產(chǎn)生直接影響[24]。賈寶艷等[25]認(rèn)為水稻的質(zhì)量和產(chǎn)量與穗部性狀是顯著的線性關(guān)系，研究穗部性狀，有利于找尋理想株型，提高水稻產(chǎn)量和質(zhì)量[26]。胡繼鑫[27]研究遼寧地區(qū)不同水稻穗部性狀發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加穗長(zhǎng)來提高產(chǎn)量。胡繼新[28]對(duì)水稻穗部研究表明，穗部性狀是產(chǎn)量結(jié)構(gòu)重要組成部分，在不同的品種中差異較大。本研究中，針對(duì)長(zhǎng)穗材料進(jìn)行了相關(guān)農(nóng)藝性狀分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)穗材料與常規(guī)品種9311相比，穗長(zhǎng)差異顯著，每穗粒數(shù)和二次枝梗數(shù)明顯較多，產(chǎn)量有所提高，說明穗部性狀與產(chǎn)量密切相關(guān)。

3.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定與差異

根據(jù)之前研究表明丙二醛、SOD、脯氨酸、可溶糖和可溶蛋白與植物的抗逆性相關(guān)。戴高興等[29]以早稻品種瑰寶8號(hào)以及耐低鉀變異后代為材料模擬干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)丙二醛、脯氨酸和SOD含量發(fā)生變化，表現(xiàn)為丙二醛、脯氨酸迅速上升，SOD先急劇上升后迅速下降。黃顯波等[30]在38 ℃高溫下以谷優(yōu)1292雜交秈稻為試驗(yàn)材料，結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，丙二醛、脯氨酸含量逐漸上升，SOD活性逐漸減低。Saladin等[32]認(rèn)為可溶性糖作為植物滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)，其含量增加，有利于植物在干旱環(huán)境中生長(zhǎng)。本研究中對(duì)獲得的長(zhǎng)穗材料進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)測(cè)定，長(zhǎng)穗材料和9311相比，幼苗期的SOD、可溶糖、莖中的葉綠素和脯氨酸含量較高，成熟期的葉中的丙二醛、根中的可溶糖和葉綠素含量較高。表明在不同的發(fā)育時(shí)期植物體內(nèi)各種物質(zhì)的含量存在差異，其生理響應(yīng)不同。與常規(guī)品種9311相比，長(zhǎng)穗材料在幼苗期的抗逆性較好，但可能隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行其抗逆性變?nèi)酢?/p>

3.3 各生理指標(biāo)間的關(guān)系及長(zhǎng)穗材料的后續(xù)研究

李佐同等[31]以抗病品種龍選9070、普粘7和感病品種麗江新團(tuán)黑谷為材料，明確了可溶糖和可溶蛋白含量高有利于增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性，說明可溶糖和可溶蛋白與水稻的抗病性相關(guān)。陳曉遠(yuǎn)等[33]測(cè)定水分脅迫下水稻品種金優(yōu)402的可溶糖和游離脯氨酸的含量，發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)，兩者的含量均上升。雷東陽(yáng)等[34]用其雜交水稻及其恢復(fù)系為材料，研究水稻抽穗揚(yáng)花期在高溫下對(duì)生理指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙二醛和可溶糖含量均升高。何開躍等[35]通過測(cè)定不同低溫和冷凍處理的福建柏苗的可溶糖和丙二醛，結(jié)果兩者含量均上升。王娟等用玉米根系為材料模擬水分脅迫，發(fā)現(xiàn)SOD和MDA的含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。本研究中筆者對(duì)丙二醛、SOD和脯氨酸等6項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析，對(duì)于長(zhǎng)穗材料而言，幼苗期莖部的脯氨酸含量和可溶糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，葉部的SOD含量和脯氨酸含量也存在極顯著的負(fù)相關(guān)性，表明在應(yīng)對(duì)環(huán)境變化過程中，有多種物質(zhì)相互作用共同參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育與機(jī)體平衡。目前，正在構(gòu)建長(zhǎng)穗材料和9311的遺傳群體，為后續(xù)定位和克隆穗長(zhǎng)相關(guān)基因奠定材料基礎(chǔ)，希望能進(jìn)一步在分子水平揭示候選基因的調(diào)控功能，為水稻的分子育種奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為水稻高產(chǎn)品種的選育提供一定的支撐。

4 結(jié) 論

長(zhǎng)穗材料穗長(zhǎng)與常規(guī)品種9311相比差異顯著，具有每穗粒數(shù)、二次枝梗數(shù)多的優(yōu)點(diǎn)，在一定程度上提高了水稻產(chǎn)量。其次，長(zhǎng)穗材料幼苗期的SOD酶活性、脯氨酸和可溶糖含量顯著高于9311，說明長(zhǎng)穗材料在幼苗期時(shí)的抗逆性較好；但是長(zhǎng)穗材料在成熟期階段的SOD酶活性和脯氨酸含量顯著低于9311，說明在生長(zhǎng)發(fā)育后期其抗逆性不如9311，可能更易受環(huán)境因素的影響。另外，各指標(biāo)間相關(guān)性分析表明，幼苗期莖部的脯氨酸含量和可溶糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)，同時(shí)葉部的SOD含量和脯氨酸含量也存在極顯著的負(fù)相關(guān)性。