咪康唑通過(guò)抑制PI3K/Akt/NOX4通路誘導(dǎo) 肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡并增敏順鉑的機(jī)制

張偉楠， 宋少飛， 劉冰， 張陸勇

(1. 廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006； 2. 廣東藥科大學(xué) 新藥研發(fā)中心, 廣東 廣州 510006)

肺癌是當(dāng)前世界最常見(jiàn)的人類惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率都居眾多癌癥之首.非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%～85%，包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌[1].對(duì)于肺腺癌，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)和c-ros原癌基因1酪氨酸激酶(c-ros oncogene 1 receptor kinase, ROS1)等驅(qū)動(dòng)基因的靶向治療藥物在臨床上得到廣泛應(yīng)用，臨床獲得較好的療效[2].不同于肺腺癌，肺鱗癌現(xiàn)有化療效果差，治療方案有限，預(yù)后不良[3].因此，亟需研發(fā)有效的抗肺鱗癌藥物及治療方案.

順鉑是常用于治療肺鱗癌的藥物之一，可與DNA鏈交叉連接，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[4].有研究表明，順鉑因可增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B(protein kinase B, PKB或Akt)磷酸化，而使其抗癌效應(yīng)降低并產(chǎn)生腫瘤耐藥[5].在臨床治療中，與化療相關(guān)的耐藥性和毒性是影響其療效的主要障礙.

老藥新用是當(dāng)前藥物研發(fā)的捷徑，既可保證藥物的安全性，又可避免漫長(zhǎng)的新藥開(kāi)發(fā)和篩選周期[6].隨著藥理學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)許多老藥在抗癌的新型靶點(diǎn)上具有活性.侵襲性真菌感染在嚴(yán)重免疫抑制的癌癥患者中很常見(jiàn)，導(dǎo)致很多癌癥病人死亡[7].肺鱗癌患者由于自身免疫功能受損，容易受真菌感染并有可能導(dǎo)致死亡[8-9].因此，合理使用抗癌藥和抗真菌藥物對(duì)癌癥患者治療極其關(guān)鍵.近年的研究表明，抗真菌藥伊曲康唑能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞活性[10]，泊沙康唑能對(duì)抗基底細(xì)胞癌的生長(zhǎng)[11].另外，也有文獻(xiàn)報(bào)道咪康唑能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的活性[12].但是唑類抗真菌藥對(duì)肺鱗癌細(xì)胞活性有無(wú)抑制作用及其對(duì)順鉑療效有無(wú)影響尚無(wú)研究報(bào)道.

本研究通過(guò)采用MTT法檢測(cè)唑類抗真菌藥對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞活力的抑制作用，以藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)為指標(biāo)評(píng)價(jià)不同抗真菌藥的抗肺鱗癌H520細(xì)胞活性的效果，選擇效果最佳的藥物深入研究其體內(nèi)外抗肺鱗癌細(xì)胞活性，并探討其相關(guān)機(jī)制，為臨床選用有效治療肺鱗癌的方案提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

咪康唑(#S2536，CAS號(hào)：22916-47-8)，硝酸布康唑(#S1833，CAS號(hào)：64872-77-1)，硝酸舍他康唑(#S3161, CAS號(hào)：99592-39-9)，噻康唑(#S1910, CAS號(hào)：65899-73-2)，聯(lián)苯卞唑(#S1854, CAS號(hào)：60628-96-8)，克霉唑(#S1606, CAS號(hào)：23593-75-1)，硝酸芬替康唑(#S2031, CAS號(hào)：73151-29-8)，硝酸硫康唑(#S4120, CAS號(hào)：61318-91-0)，硝酸異康唑(#S2534, CAS號(hào)：24168-96-5)，泊沙康唑(#S1257, CAS號(hào)：171228-49-2)，特康唑(#S5033, CAS號(hào)：67915-31-5)，艾沙康唑(#S3722, CAS號(hào)：241479-67-4)，伊曲康唑(#S2476, CAS號(hào)：84625-61-6)，鹽酸萘替康唑(#S4878, CAS號(hào)：130773-02-3)，PI3K通路抑制劑LY294002(#S1105, CAS號(hào)：154447-36-6)，NADPH氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphateoxidase 4,NOX4)抑制劑GKT137831(# S7171, CAS號(hào)：1218942-37-0)，順鉑(#S1166, CAS 號(hào)：15663-27-1)均購(gòu)于Selleck公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)于Gibco公司；細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒及Trizol購(gòu)于碧云天公司；NOX4、p-Akt、Akt及β-Tubulin抗體購(gòu)于Abcam公司；二抗山羊抗兔IgG購(gòu)于Cell Signaling Technology公司；2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)購(gòu)于Sigma公司；Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)雙染細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒購(gòu)于貝博生物公司；Rever Tra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶和SYBR Green實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液均購(gòu)于TOYOBO公司；人肺鱗癌H520細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；4～6周齡SPF級(jí)雌性BALB/c-nu/nu裸鼠，來(lái)源于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002.

流式細(xì)胞儀購(gòu)于Thermo Scientific公司(AFC2);全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)于Thermo Scientific公司(1510).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

肺鱗癌H520細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2標(biāo)準(zhǔn)加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

用MTT法檢測(cè)不同唑類抗真菌藥對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞活力的影響.將肺鱗癌H520細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，以5×103/孔接種于96孔板中.細(xì)胞貼壁后，用不同唑類抗真菌藥處理細(xì)胞48 h.藥物干預(yù)結(jié)束后，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MTT，并在37 ℃下避光孵育4 h.吸去96孔板中液體，每孔加入二甲基亞砜150 μL，并用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度值D(570 nm).細(xì)胞活力=(D實(shí)驗(yàn)組-D空白組)/(D對(duì)照組-D空白組).通過(guò)GraphPad Prism 7.01軟件，利用不同唑類抗真菌藥下肺鱗癌H520的細(xì)胞活力計(jì)算出相應(yīng)唑類抗真菌藥的IC50，以篩選出效果最佳唑類抗真菌藥及相應(yīng)濃度.

1.2.3 DCFH-DA標(biāo)記法檢測(cè)活性氧水平

用DCFH-DA探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，檢測(cè)最佳唑類抗真菌藥以及與NOX4抑制劑GKT137831聯(lián)用后對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞ROS水平的影響.將肺鱗癌H520細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后給予不同濃度的最佳唑類抗真菌藥干預(yù)處理12 h，檢測(cè)最佳唑類抗真菌藥對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞ROS的影響.將最佳唑類抗真菌藥物與濃度為20 μmol/L的 GKT137831聯(lián)用，干預(yù)處理12 h，檢測(cè)最佳唑類抗真菌藥與GKT137831聯(lián)用對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞ROS水平的影響.干預(yù)處理細(xì)胞后，培養(yǎng)皿中加入濃度為25 μmol/L的DCFH-DA，在37 ℃條件下避光孵育30 min，PBS重懸3遍，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm處對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群并畫(huà)門(mén)，分析不同組別細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度.

1.2.4 Hoechst染色法和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

(1)Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用Hoechst染色試劑盒對(duì)細(xì)胞染色，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察.將肺鱗癌H520細(xì)胞接種于含有蓋玻片的6孔板中.用不同濃度的最佳唑類抗真菌藥干預(yù)處理24 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定及染色.通過(guò)熒光顯微鏡觀察其凋亡情況，并對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

(2)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用Annexin V-FITC/ PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡[13].將肺鱗癌H520細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后給予不同濃度的最佳唑類抗真菌藥干預(yù)處理24 h.藥物干預(yù)結(jié)束后，用胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS重懸2次后，加入Annexin V結(jié)合緩沖液并在避光條件下用5 μL Annexin V-FITC孵育15 min，然后加入10 μL PI避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群并畫(huà)門(mén)，檢測(cè)不同組別細(xì)胞的凋亡率.

1.2.5 RT-qPCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)

將肺鱗癌H520細(xì)胞接種于6孔板中，每孔105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的最佳唑類抗真菌藥干預(yù)處理.4 h后，使用Trizol從細(xì)胞中提取總RNA.根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求，使用ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA(cDNA). 使用SYBR Green實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液在iCycler定量基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行 RT-qPCR.擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，總共循環(huán)40次.以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算NOX4mRNA的相對(duì)表達(dá)量[14].本實(shí)驗(yàn)研究使用引物序列見(jiàn)表1.

表1 本研究使用的相關(guān)引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.6 Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)量

Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中p-Akt、Akt及NOX4的蛋白表達(dá)量.將肺鱗癌H520細(xì)胞接種于6孔板中，每孔105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后給予不同濃度的最佳唑類抗真菌藥干預(yù)處理，藥物干預(yù)結(jié)束后加入細(xì)胞裂解緩沖液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的蛋白酶抑制劑混合物獲得全細(xì)胞提取物，并通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度.上樣后，20 V預(yù)電泳20 min，80 V電泳20 min跑濃縮膠，120 V電泳60 min跑分離膠.電泳完成后，250 mA下轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜.將PVDF膜置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉液中封閉1 h.加入稀釋后的抗體p-Akt(Vp-Akt∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、Akt(VAkt∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、NOX4(VNOX4∶V抗體稀釋液=1∶1 000)、β-Tubulin(Vβ-Tubulin∶V抗體稀釋液=1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜.用TBST洗膜3次，每次5 min.室溫孵育二抗(V二抗原液∶V抗體稀釋液=1∶5 000)1 h[15].通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體結(jié)合，使用Image J分析軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析.

1.2.7 Western blotting法分析最佳唑類抗真菌藥對(duì)NOX4及PI3K/Akt通路的影響

將最佳唑類抗真菌藥與濃度為25 μmol/L 的PI3K/Akt通路抑制劑LY294002(LY)聯(lián)用，分為對(duì)照組、最佳唑類抗真菌藥組、LY組、最佳唑類抗真菌藥+LY組，通過(guò)Western blotting法檢測(cè) LY294002與最佳唑類抗真菌藥聯(lián)用后NOX4蛋白表達(dá)量的變化，分析其對(duì)PI3K/Akt通路的影響.

1.2.8 MTT法測(cè)定協(xié)同指數(shù)

最佳唑類抗真菌藥與順鉑之間的相互作用由協(xié)同指數(shù)(combination index, CI)來(lái)確定.根據(jù)最佳唑類抗真菌藥和順鉑的IC50設(shè)置一系列濃度梯度的藥物聯(lián)用組，干預(yù)肺鱗癌H520細(xì)胞48 h，通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度的藥物聯(lián)用對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞的抑制率.根據(jù)Calcusyn2.0軟件計(jì)算其CI值，聯(lián)合作用判斷依據(jù)如下：CI<1，協(xié)同作用；CI=1，相加效應(yīng)；CI>1，拮抗作用.

1.2.9 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)探究最佳唑類抗真菌藥體內(nèi)抗腫瘤活性

將肺鱗癌H520細(xì)胞(約4×106個(gè))皮下接種到裸鼠的右腋下處.當(dāng)腫瘤體積長(zhǎng)到80～100 mm3后將成瘤裸鼠分為4組，分別為對(duì)照組，最佳唑類抗真菌藥組(50 mg/kg，2 d一次，腹腔注射給藥)，順鉑組(2 mg/kg，2 d一次，腹腔注射給藥)，最佳唑類抗真菌藥+順鉑組(50 mg/kg最佳唑類抗真菌藥+ 2 mg/kg順鉑，2 d一次，腹腔注射給藥)，每組6只.用以下公式計(jì)算腫瘤大?。耗[瘤體積(mm3)=(腫瘤長(zhǎng)度×腫瘤寬度×腫瘤寬度)×0.5，每隔一天測(cè)量一次腫瘤體積.給藥28 d后，處死裸鼠收集腫瘤組織并稱量腫瘤重量.最后，通過(guò)免疫組化分析腫瘤組織中p-Akt和NOX4的表達(dá)量.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)等計(jì)量資料均重復(fù)3次并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，應(yīng)用GraphPad Prism 7.01軟件，對(duì)兩組間計(jì)量資料進(jìn)行Student’s test檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)采用單向方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 唑類抗真菌藥抑制肺鱗癌H520細(xì)胞活力

通過(guò)MTT法檢測(cè)唑類抗真菌藥在肺鱗癌H520細(xì)胞中的抑制效應(yīng).選擇濃度范圍為0～40 μmol/L的不同唑類抗真菌藥干預(yù)肺鱗癌H520細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示，14種唑類抗真菌藥對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞活性均有抑制作用，其中咪康唑IC50為(4.95±0.33) μmol/L，抑制效果最佳(表2).故選擇咪康唑作為最佳唑類抗真菌藥進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2 咪康唑?qū)Ψ西[癌H520細(xì)胞凋亡的影響

基于咪康唑的IC50值，根據(jù)藥物的量效關(guān)系理論，選擇一定濃度范圍(0、2、4、8 μmol/L)的咪康唑干預(yù)肺鱗癌H520細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響.結(jié)果顯示，處理24 h后，咪康唑可呈劑量依賴性誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡(圖1).

表2 不同唑類抗真菌藥對(duì)H520細(xì)胞活力的影響

A：咪康唑干預(yù)肺鱗癌H520細(xì)胞24 h后，Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡(×100)；B：咪康唑干預(yù)肺鱗癌H520細(xì)胞24 h后，Annexin V-FITC/PI染色并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況. 1)與對(duì)照組比較，P<0.01.

2.3 咪康唑通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡

不同濃度(0、2、4、8 μmol/L)咪康唑干預(yù)肺鱗癌H520細(xì)胞12 h，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞中ROS水平的變化.結(jié)果顯示咪康唑可劑量依賴性降低肺鱗癌H520細(xì)胞中ROS水平(圖2A)，并可有效降低濃度為100 μmol/L的雙氧水所造成的ROS水平升高程度(圖2B).后續(xù)為深入探討咪康唑誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡的機(jī)制并有效呈現(xiàn)其潛在增敏化療藥物的效應(yīng)，本研究選取稍低于IC50的濃度4 μmol/L作為最佳藥物濃度進(jìn)行下一步深入研究.結(jié)果表明，濃度為4 μmol/L的咪康唑及濃度為100 μmol/L的雙氧水處理24 h后，咪康唑能夠有效降低雙氧水所誘導(dǎo)的肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡(圖2C).

A：咪康唑處理肺鱗癌H520細(xì)胞12 h后，DCFH-DA探針標(biāo)記并用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平；B：咪康唑與雙氧水處理肺鱗癌H520細(xì)胞12 h后，DCFH-DA探針標(biāo)記并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平；C：咪康唑與雙氧水處理肺鱗癌H520細(xì)胞24 h后，Annexin V-FITC/PI雙染并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡. 1)與對(duì)照組比較，P<0.01，2)與雙氧水組比較，P<0.01.

2.4 咪康唑通過(guò)抑制NOX4而降低ROS水平

為進(jìn)一步探討咪康唑減少ROS的產(chǎn)生和誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡的機(jī)制，將不同濃度(0、2、4、8 μmol/L)的咪康唑處理肺鱗癌H520細(xì)胞4 h，采用RT-qPCR法檢測(cè)NOX4 mRNA的表達(dá).結(jié)果表明，咪康唑可劑量依賴性降低NOX4 mRNA的表達(dá)(圖3A).此外，上述濃度的咪康唑處理肺鱗癌H520細(xì)胞12 h后，可顯著降低NOX4蛋白表達(dá)量(圖3B).

A：咪康唑處理肺鱗癌H520細(xì)胞4 h后，檢測(cè)細(xì)胞中NOX4 mRNA水平的變化； B：咪康唑處理肺鱗癌H520細(xì)胞12 h后，用western blotting檢測(cè)細(xì)胞中NOX4蛋白表達(dá)量的變化；C：咪康唑和GKT137831(GKT)處理肺鱗癌H520細(xì)胞12 h后，DCFH-DA標(biāo)記并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；D:咪康唑和GKT137831(GKT)處理肺鱗癌H520細(xì)胞24 h后，Annexin V-FITC/PI雙染并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響. 1)與對(duì)照組相比，P<0.01；2)與GKT組比較，無(wú)顯著差異.

濃度為20 μmol/L的GKT137831處理肺鱗癌H520細(xì)胞12 h能有效抑制細(xì)胞內(nèi)ROS水平(圖3C).當(dāng)濃度為20 μmol/L的GKT137831抑制NOX4活性后，濃度為4 μmol/L的咪康唑沒(méi)有進(jìn)一步降低ROS水平.單獨(dú)使用濃度為4 μmol/L的咪康唑或濃度為20 μmol/L的GKT137831后可誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡，而咪康唑與GKT137831合用則不能進(jìn)一步增加肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡程度(圖3D).上述結(jié)果表明，咪康唑可能通過(guò)抑制NOX4表達(dá)，從而減少ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡.

2.5 咪康唑通過(guò)抑制PI3K/Akt通路而抑制NOX4表達(dá)

不同濃度(0、2、4、8 μmol/L)的咪康唑處理肺鱗癌H520細(xì)胞6 h，結(jié)果顯示，咪康唑可劑量依賴性降低p-Akt蛋白表達(dá)量，總Akt蛋白表達(dá)量不變，表明咪康唑可抑制該通路活性(圖4A).在肺鱗癌H520細(xì)胞中單獨(dú)添加濃度為25 μmol/L的LY294002或濃度為4 μmol/L的咪康唑，12 h后，兩者均可使NOX4蛋白含量下降，但是兩藥合用后，NOX4蛋白表達(dá)量與單獨(dú)使用LY294002后相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4B).以上結(jié)果提示，咪康唑可能通過(guò)抑制PI3K/Akt通路降低NOX4表達(dá)量.

2.6 咪康唑增敏順鉑并誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡

上述結(jié)果證明，咪康唑可抑制肺鱗癌H520細(xì)胞p-Akt表達(dá)量，所以推測(cè)其可抵抗順鉑所造成的p-Akt表達(dá)升高，從而增加順鉑的抗癌活性.如圖5A所示，順鉑處理肺鱗癌H520細(xì)胞48 h后，可劑量依賴性抑制肺鱗癌H520細(xì)胞存活率，且IC50為(5.66±0.13) μmol/L. 4 μmol/L順鉑和2 μmol/L咪康唑及二者聯(lián)用干預(yù)肺鱗癌H520細(xì)胞6 h，結(jié)果顯示，單獨(dú)使用咪康唑能有效抑制Akt磷酸化，而單獨(dú)使用順鉑，則升高Akt磷酸化水平.兩藥聯(lián)用后，咪康唑能有效減少順鉑所致的Akt磷酸化水平升高(圖5B).

A：咪康唑處理肺鱗癌H520細(xì)胞6 h后，western blotting檢測(cè)細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)的變化；B：咪康唑和LY294002(LY)處理肺鱗癌H520細(xì)胞12 h后，western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中NOX4表達(dá)的變化.1)與對(duì)照組比較，P<0.01，2)與LY組比較無(wú)顯著差異.

A：順鉑處理肺鱗癌H520細(xì)胞48 h后，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；B：咪康唑和順鉑處理肺鱗癌H520細(xì)胞6 h后，通過(guò)western blotting檢測(cè)p-Akt蛋白表達(dá)量的變化；C：咪康唑和順鉑處理肺鱗癌H520細(xì)胞24 h后，用Annexin V-FITC/PI雙染并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)凋亡的影響；D：不同濃度咪康唑與不同濃度順鉑聯(lián)合用藥48 h后的協(xié)同指數(shù)CI.1)與對(duì)照組比較，P<0.05；2)與順鉑組比較，P<0.05；3)與咪康唑組比較，P<0.01.

藥物處理24 h后，2 μmol/L咪康唑與4 μmol/L順鉑均能誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡，聯(lián)合使用后，凋亡率顯著高于兩藥單獨(dú)使用時(shí)(圖5C).根據(jù)咪康唑與順鉑在肺鱗癌H520細(xì)胞的IC50值，藥物聯(lián)用的系列濃度設(shè)定為：對(duì)照組； 1.25 μmol/L咪康唑+1.5 μmol/L順鉑組；2.5 μmol/L咪康唑+3 μmol/L順鉑組；5 μmol/L咪康唑+6 μmol/L順鉑組；10 μmol/L咪康唑+12 μmol/L順鉑組；20 μmol/L咪康唑+24 μmol/L順鉑組.聯(lián)合處理肺鱗癌H520細(xì)胞48 h后可得分?jǐn)?shù)效應(yīng)與組合指數(shù)曲線.隨著聯(lián)合給藥的濃度增加，藥物協(xié)同指數(shù)從2.5 μmol/L咪康唑+3 μmol/L順鉑組開(kāi)始均小于1，表明3～24 μmol/L順鉑聯(lián)合2.5～20 μmol/L咪康唑可對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞增殖抑制效果存在協(xié)同效應(yīng)(CI<1).

2.7 咪康唑體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)

經(jīng)過(guò)28 d給藥后，3個(gè)給藥組均可抑制腫瘤生長(zhǎng)(圖6 A、B、C)，咪康唑與順鉑聯(lián)用較單獨(dú)用藥抑瘤效果顯著增強(qiáng).使用NOX4和p-Akt抗體分別對(duì)裸鼠皮下腫瘤進(jìn)行免疫組化分析的結(jié)果所示，與對(duì)照組相比，咪康唑處理組中NOX4和p-Akt表達(dá)量顯著降低，且咪康唑能減少順鉑使用后p-Akt的表達(dá)量升高(圖6 D、E).

A-C：裸鼠皮下腫瘤經(jīng)過(guò)咪康唑和順鉑處理28 d后的體積及重量；D：裸鼠皮下腫瘤經(jīng)過(guò)咪康唑和順鉑處理28 d后，通過(guò)免疫組化檢測(cè)其對(duì)NOX4蛋白含量的變化(×200)；E：裸鼠皮下腫瘤經(jīng)過(guò)咪康唑和順鉑處理28 d后，通過(guò)免疫組化檢測(cè)其對(duì)p-Akt蛋白含量的變化(×200). 1)與對(duì)照組比較，P<0.01.

3 討論

由于化療時(shí)間長(zhǎng)，免疫系統(tǒng)衰弱，癌癥患者常發(fā)生真菌感染.因此，在臨床治療中，抗癌藥與抗真菌藥發(fā)揮不可或缺的作用[16].唑類藥物(三唑和咪唑衍生物)廣泛用于治療淺部和深層真菌感染[17].既往研究已證實(shí)幾種唑類抗真菌藥在多種癌癥中具有抗癌作用.在本研究中，通過(guò)篩選一系列唑類抗真菌藥，發(fā)現(xiàn)咪康唑?qū)Ψ西[癌H520細(xì)胞的活性抑制效果最好，其IC50最低.

ROS作為信號(hào)分子參與許多癌癥生物學(xué)過(guò)程.與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞通常具有較高水平的ROS，這對(duì)于癌細(xì)胞增殖及凋亡抵抗起著重要作用[18].因此，通過(guò)干預(yù)ROS水平破壞氧化還原平衡可能是治療癌癥的有效途徑.許多藥物已被證明通過(guò)下調(diào)ROS可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[19].本研究中，咪康唑通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，咪康唑能顯著抑制NOX4的表達(dá)，繼而導(dǎo)致肺鱗癌H520細(xì)胞的ROS減少，提示咪康唑可能通過(guò)抑制NOX4的表達(dá)，進(jìn)一步破壞細(xì)胞內(nèi)ROS平衡，最終誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡.

NOX的生物學(xué)功能主要是產(chǎn)生超氧化物(O2-)或過(guò)氧化氫(H2O2).它們由七個(gè)成員組成，代表不同的催化亞基： NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2. NOX已被證實(shí)與許多疾病相關(guān)，尤其是癌癥[20].NOX4在癌細(xì)胞中的表達(dá)受PI3K/Akt通路調(diào)控.本研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt通路是咪康唑降低肺鱗癌H520細(xì)胞中NOX4表達(dá)的原因.然而，順鉑可以增加磷酸化Akt的表達(dá)量，從而減少其細(xì)胞毒性作用[21-22].抑制PI3K/Akt活性可以增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[23-24].本研究發(fā)現(xiàn)，咪康唑可以抵消順鉑對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞PI3K/Akt活性的增強(qiáng)作用，且咪康唑可以增加順鉑對(duì)肺鱗癌H520細(xì)胞的毒性.因此，咪康唑有可能作為一種具有廣闊發(fā)展前景的新型肺鱗癌輔助化療藥物.

本研究中，咪康唑在體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制作用與順鉑相當(dāng)，聯(lián)合治療明顯優(yōu)于單一藥物治療.免疫組化數(shù)據(jù)顯示，咪康唑降低NOX4的表達(dá)，減少順鉑對(duì)腫瘤組織p-Akt活性的增強(qiáng)作用.綜上所述，咪康唑可通過(guò)抑制PI3K/Akt/NOX4通路，減少細(xì)胞內(nèi)ROS從而誘導(dǎo)肺鱗癌H520細(xì)胞凋亡并增敏順鉑.因此，咪康唑可能是肺鱗癌輔助治療的一個(gè)有前景的候選藥物.