一種新型體外溶血檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用

蔣群芳， 張崇林， 秦益民， 吳革成， 李奇

(桂林市婦女兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 廣西 桂林 541001)

目前我國(guó)紅細(xì)胞的同型輸注，主要針對(duì)ABO和RhD血型，僅有為數(shù)不多的醫(yī)院開(kāi)展Rh血型系統(tǒng)(C、c、D、E、e)同型輸血，除此之外還有41個(gè)血型系統(tǒng)尚未檢測(cè).在對(duì)獻(xiàn)血者和受血者常規(guī)進(jìn)行ABO、RhD表型鑒定、不規(guī)則抗體篩查同時(shí)，還應(yīng)積極檢測(cè)其他具有臨床意義的血型系統(tǒng)，如MNS、P、Rh、Lutheran、Duffy、Kidd及Diego等[1-2].尤其是有反復(fù)輸血史的患者，在首次輸血會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生同種抗體與紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合發(fā)生溶血以清除抗原，隨后抗體水平下降維持在低水平，而現(xiàn)有的檢測(cè)手段很難檢測(cè)其存在.但當(dāng)含有相同血型抗原的紅細(xì)胞再次輸注后，免疫系統(tǒng)會(huì)快速響應(yīng)并分泌大量的抗體以清除體內(nèi)抗原，即二次免疫應(yīng)答[3-4]，患者發(fā)生溶血性輸血反應(yīng)，出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命[2-3].為解決這一棘手問(wèn)題，亟需建立一項(xiàng)靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、特異性強(qiáng)且便于普及的溶血檢測(cè)技術(shù)，為此本研究將不規(guī)則抗體檢測(cè)試驗(yàn)和膠體金法檢測(cè)血紅蛋白結(jié)合在一起，建立一種新型體外溶血檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)概述如下.

1 材料和方法

1.1 材料

收集2018年3月至2020年2月我院不規(guī)則抗體篩查陽(yáng)性的血清學(xué)標(biāo)本33例，排除檢測(cè)前已發(fā)生溶血或存有紅細(xì)胞脆性病人(如遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、自身免疫性溶血性貧血及陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿等疾病)樣本，通過(guò)抗體鑒定明確其抗體類(lèi)型后保存至-20 ℃以下備用.抗體篩查紅細(xì)胞購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，膠體金檢測(cè)試紙條購(gòu)自北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 AB型標(biāo)準(zhǔn)新鮮冰凍血漿的制備

將篩檢紅細(xì)胞或譜紅細(xì)胞配制體積濃度為0.5%～0.8%紅細(xì)胞懸液，取50 μL加入微柱凝膠卡各孔中，分別加入被檢血清1滴(50 μL)，加樣后將其置于37 ℃孵育器中孵育15 min；孵育結(jié)束后離心(900 r/min離心2 min，1 500 r/min離心3 min)，取出凝膠卡肉眼觀察并判讀結(jié)果，所有被檢紅細(xì)胞沉于微柱凝膠的底部為陰性，反應(yīng)結(jié)果陰性的血漿為合格.取上述檢測(cè)陰性的血漿50 μL，加入1.95 mL PBS后，將膠體金試紙條插入其中，5 min后觀察并讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，膠體金試紙條陰性為合格.

1.2.2 抗原嵌和紅細(xì)胞懸液制備

包括兩種RhD陽(yáng)性細(xì)胞(CCDee、Cw+和ccDEE)和一種RhD陰性細(xì)胞(ccdee)、雙倍劑量的Fya、Fyb、Jka、Jkb、M、S和s，以及至少一種對(duì)K、Lea、Leb、P1、N、Mia、和Dia呈陽(yáng)性的細(xì)胞.然后各取一份上述紅細(xì)胞懸液按照體積比1∶1∶1的比例加于試管中混勻，PBS離心洗滌3次后，取最后1次洗滌的PBS溶液，將隱血試紙條置于其中，5 min后觀察并讀取結(jié)果，膠體金試紙條陰性為合格.

1.2.3 反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)的選擇

膠體金試紙條的敏感范圍在1～625 mg/L[5-6]，正常人血漿中游離血紅蛋白質(zhì)量濃度<40 mg/L(鄰-甲聯(lián)苯胺法)，若整個(gè)反應(yīng)體系直接用血漿稀釋會(huì)增加實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性,因此需要將血漿適當(dāng)稀釋.取40例正常人血漿分別作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40及1∶80稀釋?zhuān)瑢㈦[血試紙條置于其中5 min后觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性率分別為17.50%(7/40)、7.50%(3/40)、2.5%(1/40)、0(0/40)、0(0/40)，選取40倍稀釋為最佳稀釋倍數(shù).

1.2.4 單個(gè)核細(xì)胞的分離

取0.5 mL Ficoll移入1.5 mL 的EP管中，用移液槍吸取1.0 mL抗凝外周血，緩緩疊加至Ficoll上層，室溫下2 000 r/min離心20 min后小心打開(kāi)EP管蓋子，取單個(gè)核細(xì)胞層用PBS洗滌3次，然后用患者血漿將其重懸，備用.

1.2.5 溶血結(jié)果的檢測(cè)與判讀

分別取體積濃度為0.5%～0.8%的指示紅細(xì)胞懸液100 μL加入1號(hào)和2號(hào)EP管中，隨后加入上述待檢細(xì)胞懸液100 μL.(1)直接法：將1號(hào)管輕輕振蕩混勻后置于25 ℃孵育1 h，孵育結(jié)束后用PBS洗滌3次，然后加入AB型標(biāo)準(zhǔn)新鮮冰凍血漿(含有補(bǔ)體系統(tǒng)的所有有效組分)200 μL，置于37 ℃孵育4 h，孵育結(jié)束后取50 μL上述懸液加入1.95 mL PBS中，混勻后將隱血試紙條插入其中，5 min后觀察并讀取結(jié)果.(2)間接法：將2號(hào)EP管輕輕振蕩混勻后置于37 ℃孵育1 h，孵育結(jié)束后用PBS洗滌3次，依次加入1滴Coombs試劑和200 μL AB型標(biāo)準(zhǔn)新鮮冰凍血漿振蕩混勻后繼續(xù)置于37 ℃孵育4 h，孵育結(jié)束后取50 μL上述懸液加入1.95 mL PBS中，混勻后將隱血試紙條插入其中，5 min后觀察并讀取結(jié)果，檢測(cè)原理如圖1所示.

結(jié)果判讀如下：(1)1號(hào)和2號(hào)管陰性：患者體內(nèi)不含有同種抗體和自身抗體.(2)1號(hào)管陽(yáng)性，2號(hào)管陰性：患者體內(nèi)含有可導(dǎo)致供者紅細(xì)胞溶血的IgM型同種抗體或自身抗體.(3)1號(hào)管陰性，2號(hào)管陽(yáng)性：患者體內(nèi)含有可導(dǎo)致供者紅細(xì)胞溶血的IgG型同種抗體或自身抗體.(4)1號(hào)和2號(hào)管均陽(yáng)性：患者體內(nèi)含有可導(dǎo)致供者紅細(xì)胞溶血的IgM型和IgG型混合同種抗體或自身抗體.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 19.0非參數(shù)檢測(cè)(Mann-Whitney Test)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 不同性質(zhì)不規(guī)則抗體(IgG/IgM型)的檢測(cè)

通過(guò)對(duì)正常人血漿不同反應(yīng)強(qiáng)度的IgG型不規(guī)則抗體檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)IgG型抗紅細(xì)胞抗原抗體的反應(yīng)強(qiáng)度在+/-至4+時(shí)，新型體外溶血技術(shù)均可有效檢出抗體存在；其他兩種方法中凝膠卡法可檢出IgG型抗體，鹽水法均未檢出IgG抗體；上述3種方法陰性質(zhì)控均為陰性.當(dāng)IgM型抗紅細(xì)胞抗原抗體的反應(yīng)強(qiáng)度在+/-至4+時(shí)，該技術(shù)均可有效檢出抗體存在；其他兩種方法中鹽水法均可檢出IgM抗體，當(dāng)IgM型抗體的反應(yīng)強(qiáng)度在+/-至2+時(shí)，凝膠卡法檢出效果較差，當(dāng)IgM型抗體的反應(yīng)強(qiáng)度在3+至4+時(shí)，凝膠卡法檢測(cè)結(jié)果僅為1+至2+，與鹽水法不匹配；上述3種方法陰性質(zhì)控均為陰性.故新型溶血技術(shù)對(duì)不同性質(zhì)不規(guī)則抗體(IgG/IgM型)檢測(cè)率高于鹽水法和凝膠法.具體結(jié)果如表1.

表1 IgG/IgM型抗體在不同檢測(cè)方法下反應(yīng)強(qiáng)度1) (n≥3)Table 1 The reaction intensity of IgG/IgM antibody in different detection methods (n≥3)

2.2 不同種類(lèi)不規(guī)則抗體的檢測(cè)

通過(guò)對(duì)20種抗紅細(xì)胞抗體檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)比鹽水法和凝膠卡法具有優(yōu)勢(shì)，不受抗體種類(lèi)影響，可有效檢出各種不同種類(lèi)的不規(guī)則抗體，如 Rh、MNSs、Duffy、Kidd、Lewis及JMH系統(tǒng)和自身抗體，詳見(jiàn)表2.

表2 新型體外溶血檢測(cè)技術(shù)對(duì)不同種類(lèi)型不規(guī)則抗體的檢測(cè)

2.4 3種方法檢測(cè)結(jié)果比較

新型溶血技術(shù)、鹽水法及凝膠卡法同時(shí)對(duì)33例不同種類(lèi)、不同性質(zhì)的自身抗體或同種抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示3種檢測(cè)方法檢測(cè)出陽(yáng)性分別為33例、6例、29例.在抗體篩查方面，新型溶血技術(shù)較鹽水法具有更高的檢出率(Z=-6.708，P<0.01)；與凝膠卡法相比，亦具有更高的檢出率(Z=-2.048，P<0.05).結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 3種方法不同檢測(cè)結(jié)果比較Table 3 The comparison by three methods

3 討論

目前我國(guó)輸血人群中紅細(xì)胞抗體出現(xiàn)頻率較高，為2%左右，以Rh系統(tǒng)最為常見(jiàn)，占74.3%以上，其次為L(zhǎng)ewis、MNSs及Kidd等血型系統(tǒng)，分別占8.5%、3.9%和1.0%左右[7].其原因是我國(guó)紅細(xì)胞的同型輸注，僅針對(duì)ABO和RhD血型.歐洲早在2004年就已經(jīng)建立了完善的輸血免疫檢測(cè)體系，對(duì)輸血前后的全過(guò)程進(jìn)行精準(zhǔn)監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，2005～2009年每年輸血后發(fā)生同種免疫比例明顯降低，每輸注100 000單位血液產(chǎn)生新抗體的病例僅為0.59例[7-8].因此建立完善的輸血檢測(cè)體系，降低同種抗體產(chǎn)生的溶血性輸血反應(yīng)勢(shì)在必行.溶血性輸血反應(yīng)是由于患者體內(nèi)血型抗體致敏輸入的紅細(xì)胞導(dǎo)致破壞，如紅細(xì)胞的破壞由IgM型抗體和補(bǔ)體引起，紅細(xì)胞膜上的血型抗原被抗體致敏后，可固定并激活補(bǔ)體連鎖反應(yīng)，最后形成膜攻擊復(fù)合物并穿透紅細(xì)胞膜，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞血管內(nèi)溶血[9-10].IgG抗體與IgM不同，致敏紅細(xì)胞后部分激活補(bǔ)體反至C3b階段，被IgG抗體或補(bǔ)體片段C3b致敏后，被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的單核-巨噬細(xì)胞吞噬破壞，從循環(huán)中清除消失[11-12]，故借助膠體金法高敏感性特點(diǎn)檢測(cè)反應(yīng)體系中溶血后的血紅蛋白，建立一種新型體外溶血檢測(cè)技術(shù).

本研究與傳統(tǒng)方法不同，不僅僅局限于血漿中不規(guī)則抗體的檢測(cè)，還包括活化的B淋巴轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞再次接觸相同抗原刺激時(shí)產(chǎn)生大量的抗體，因此以患者體內(nèi)活化后的單個(gè)核細(xì)胞(富含活化的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞)及血漿共同作為待檢樣品，充分模擬體內(nèi)溶血的過(guò)程.具體優(yōu)點(diǎn)如下：(1)首次開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)模擬體內(nèi)溶血的檢測(cè)試劑盒，以往大部分試劑盒主要用于檢測(cè)是否有體外凝集，而對(duì)體外溶血的檢測(cè)力度不夠.(2)檢測(cè)范圍廣，該試劑盒可用于檢測(cè)抗A抗體和抗B抗體以外針對(duì)所有血型抗原的IgG和IgM類(lèi)不規(guī)則抗體(如抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、抗-K、抗-k、抗-JKa、抗-JKb、抗-Fya、抗-Fyb、抗-Lea、抗-Leb、抗-M、抗-N、抗-S、抗-s、抗-P、抗-Mia、抗-Dia等).(3)靈敏度高，膠體金試紙條或Hb蛋白質(zhì)量濃度檢測(cè)可檢測(cè)質(zhì)量濃度低至1 μg/mL的血紅蛋白，提高了檢測(cè)敏感性.(4)檢測(cè)特異性強(qiáng)，抗原抗體反應(yīng)的高度專(zhuān)一性決定了該檢測(cè)技術(shù)具有高度特異性[6，8].(5)可用于抗體類(lèi)型的鑒定，直接法檢測(cè)到的溶血為IgM型抗體所致，其他類(lèi)型的抗體由于溶血效應(yīng)較低，不能直接檢測(cè)；間接法，即在IgG型抗體致敏RBC后再加入抗Ig二抗，使抗血細(xì)胞抗原抗體IgG與抗Ig抗體結(jié)合成復(fù)合物，此時(shí)便可活化補(bǔ)體導(dǎo)致溶血.(6)該技術(shù)的建立有效降低免疫抗體的產(chǎn)生及溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生，尤其有益于地中海貧血、再生障礙性貧血等需要反復(fù)輸血，甚至終身輸血患者的長(zhǎng)期生存.

綜上所述，本研究將體外不規(guī)則抗體檢測(cè)試驗(yàn)和膠體金法檢測(cè)血紅蛋白結(jié)合起來(lái)，以患者體內(nèi)活化后的單個(gè)核細(xì)胞及血漿共同作為待檢樣品，充分模擬體內(nèi)溶血過(guò)程，成功建立了一種新型體外溶血檢測(cè)技術(shù)，可有效檢出各種類(lèi)型的不規(guī)則抗體，避免反復(fù)輸血患者的溶血性輸血反應(yīng).