MGLL在前列腺癌組織中的表達(dá)及其對癌細(xì)胞生長的調(diào)控作用

陳南輝, 鐘偉楓, 潘斌, 王曉紅, 黃志成, 江惠明, 譚萬龍

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 南方醫(yī)院 泌尿外科， 廣東 廣州 510515； 2.梅州市人民醫(yī)院 泌尿外科， 廣東 梅州 514031；3.暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 泌尿外科， 廣東 廣州 510632； 4.南方醫(yī)科大學(xué) 第三附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科， 廣東 廣州 510515)

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性常見的惡性腫瘤之一，PCa發(fā)病率在我國逐年增高，其死亡率也隨著年齡增長而上升[1].其發(fā)病起病隱匿、大多數(shù)患者確診時已到晚期，目前臨床治療以手術(shù)及雄激素阻斷為主，但激素依賴性PCa治療大部分會發(fā)展成為去勢抵抗性PCa，進(jìn)一步增加治療難度[2].由于PCa發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明，對于晚期PCa尚未有有效治療手段[3-4].因此探討PCa的發(fā)病機(jī)制，探索PCa的早期診斷標(biāo)記物，對于PCa的預(yù)防和前期診治具有重要的意義.

單酰甘油酯酶(monoacylglycerol lipase, MGLL)是一種催化單酰基甘油轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸(FFA)和甘油的脂解酶，與脂質(zhì)代謝相關(guān)[5].MGLL在動脈硬化、缺血再灌注損傷等疾病模型中發(fā)揮重要作用，如水解內(nèi)源性大麻素2-花生四烯酰甘油[6-7].有研究表明，MGLL被證實參與多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，比如黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]、肝癌[10]和結(jié)直腸癌[11].然而目前MGLL在PCa中的作用尚未明確，亟待研究分析.本研究利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘的方法，分析MGLL在癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)和Oncomine等癌癥公共數(shù)據(jù)庫中PCa中的表達(dá)情況及其對PCa病人的臨床預(yù)后，而后通過Western blot及Transwell等實驗在前列腺細(xì)胞癌系中對其功能進(jìn)行驗證.

1 材料和方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)挖掘

Oncomine(https://www.oncomine.org)數(shù)據(jù)庫是一個基于已發(fā)表文獻(xiàn)的基因芯片收集數(shù)據(jù)庫和集成數(shù)據(jù)挖掘平臺，可根據(jù)自己的需求設(shè)定數(shù)據(jù)集篩選條件，本研究設(shè)定的條件為：(1)Cancer Type: Prostate cancer；(2)Gene：MGLL；(3)Data Type：mRNA；(4)Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；(5)條件：P<0.05, fold change>2, rank=top 20%.

1.2 TCGA數(shù)據(jù)挖掘

通過基因表達(dá)譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)工具對TCGA中PCa的MGLL基因表達(dá)進(jìn)行分析，包括：PCa組織差異表達(dá)、患者生存分析和相似基因檢測.篩選設(shè)定條件為：(1)表達(dá)模塊.選擇MGLL及Match TCGA normal data；(2)生存分析模塊.Survival Plots(生存圖表)選擇MGLL，Overall Survival (總體生存率)或者 Disease Free Survival(無病生存率)；(3)Correlation 相關(guān)性模塊.MGLL與FGFR1、PIK3CA、AKT2和GSK3B.

1.3 MGLL蛋白水平分析

人類蛋白質(zhì)圖譜(the human protein atlas,THPA)在線工具(https://www.proteinatlas.org)通過整合人體不同組織器官的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，收集展示了多種正常及癌組織的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果.本研究檢索MGLL在PCa及正常組織中的免疫組織化學(xué)染色情況.

1.4 MGLL基因克隆及過表達(dá)

在Genebank上搜索人MGLL基因序列(NM_007283.1)，設(shè)計并合成目的基因引物，并將MGLL克隆與pEGFP-C1質(zhì)粒，最終經(jīng)測序肯定該質(zhì)粒構(gòu)建成功.而后該基因過表達(dá)與人PCa細(xì)胞系DU145細(xì)胞，采用Western blot 方法檢測GFP-MGLL蛋白的表達(dá)水平.采用Lipofectamine 2000 (Promega)對PCa細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，觀察細(xì)胞遷移和侵襲情況.

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與Transwell細(xì)胞遷移和侵襲

人PCa細(xì)胞系PC3及DU145細(xì)胞由暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供.細(xì)胞于RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，細(xì)胞融合至90%，采用Lipofectamine 2000 試劑盒轉(zhuǎn)染GFP-MGLL及GFP空載體.細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，用100 μL無血清重懸轉(zhuǎn)入Transwell小室，進(jìn)行遷移和侵襲(鋪Matrigel膠)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后取出小室，體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌1次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌干凈，于顯微鏡下觀察細(xì)胞是否穿透小孔，并拍照記錄，200倍光鏡選取5個視野記錄穿膜細(xì)胞個數(shù)，實驗重復(fù)3次.

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Rstudio 1.2.5033對篩選數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較MGLL的表達(dá)差異采用t檢驗.全部采用在線工具分析的P值結(jié)果.生存分析為Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗.MGLL與信號通路相關(guān)蛋白的共表達(dá)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析.

2 結(jié)果

2.1 MGLL mRNA水平在正常及PCa組織間的表達(dá)差異

Oncomine數(shù)據(jù)庫共檢索到6個包含MGLLmRNA表達(dá)差異的隊列研究，Meta分析提示，MGLL基因在PCa樣本中顯著低表達(dá)(P=0.021，圖1).圖2進(jìn)一步展示了每個隊列研究中MGLLmRNA的表達(dá)水平在PCa和正常組織中的表達(dá)情況，顯示MGLLmRNA水平均顯著下調(diào)(6個隊列數(shù)據(jù)分別如下：t=-3.547,P<0.001;t=-1.178,P=0.014;t=-2.822,P=0.003;t=-2.801,P=0.005;t=-1.977,P=0.029;t=-2.337,P=0.013).

為進(jìn)一步肯定MGLL 蛋白表達(dá)水平的差異，本研究通過THPA在線工具搜索并分析了MGLL在正常及PCa組織中的蛋白表達(dá)水平.結(jié)果表明，MGLL蛋白主要分布在細(xì)胞胞漿部分，在正常前列腺組織中高表達(dá)，而在癌組織中低表達(dá)或不表達(dá)(圖3)，與其mRNA結(jié)果趨勢一致.

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中基于GEO數(shù)據(jù)的Meta分析結(jié)果

A: Grasso prostate 研究(GSE35988)；B: Liu prostate研究(E-TABM-26)；C: Taylor prostate 3 研究(GSE21034)；D: Vanaja prostate研究(PMID: 12873976)；E: Welsh prostate研究(PMID: 11507037)；F: Yu prostate 研究(GSE6919).

A:前列腺正常組織，來源于THPA網(wǎng)站(Patient id：2053).B:PCa組織，來源于THPA網(wǎng)站(Patient id：2828).

2.2 MGLL表達(dá)與PCa預(yù)后的相關(guān)性

GEPIA在線工具分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中的52例正常前列腺組織及492例PCa組織.圖4A所示MGLL的mRNA水平同樣在PCa組織中顯著下調(diào)(P<0.001).進(jìn)一步分析了MGLLmRNA水平與PCa患者總生存期(overall survival，OS)及無病生存期(diseasefree survival,DS)的關(guān)系，按50%中位數(shù)樣本進(jìn)行截斷分為MGLL高表達(dá)和低表達(dá)組.如圖4B和C所示，MGLL表達(dá)水平對患者的OS及DFS均存在顯著影響.與高表達(dá)組相比，MGLL低表達(dá)的PCa患者中位OS和DFS均顯著縮短(P=0.018;P=0.934).

2.3 MGLL與FGF/PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵分子在PCa中表達(dá)的相關(guān)性

因目前MGLL與PCa發(fā)生發(fā)展的機(jī)制不清，為探索MGLL基因在PCa中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析了MGLL與成纖維細(xì)胞生長因子受體FGFR1、PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵分子如AKT2、GSK3B、脂酰肌醇3-激酶催化亞基 α (PIK3CA)在PCa族中的表達(dá)相關(guān)性，Pearson 相關(guān)性分析顯示，MGLL與FGFR1、PIK3CA、AKT2、GSK3B的表達(dá)均呈正相關(guān)(R=0.6,P=0;R=0.36,P=0;R=0.22,P<0.001;R=0.36,P=0;R=0.5,P=0，圖5).

2.4 MGLL 在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)及其對細(xì)胞遷移和侵襲的影響

前面的分析表明MGLL可能是個抑癌因子，為進(jìn)一步證實，本小組通過實驗觀察了MGLL在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)情況.如圖6A、B所示，RWPE-1是人正常前列腺上皮細(xì)胞，為對照細(xì)胞系；LNCap、DU145、PC3均為PCa細(xì)胞系.Western blot檢測表明，MGLL在多個PCa細(xì)胞系中低表達(dá)(P<0.05).進(jìn)一步構(gòu)建了用于過表達(dá)的GFP-MGLL質(zhì)粒，在DU145細(xì)胞中肯定了該質(zhì)粒的表達(dá)情況(圖6C).將該質(zhì)粒于DU145及PC3細(xì)胞中過表達(dá)，而后通過Transwell實驗觀察MGLL對細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響.結(jié)果表明過表達(dá)MGLL之后，PCa細(xì)胞系的遷移(圖6D)和侵襲(圖6E)能力顯著減弱(P<0.05)，說明MGLL在PCa細(xì)胞系中低表達(dá)，上調(diào)MGLL水平可抑制PCa遷移和侵襲，MGLL為抑癌因子.

A: GEPIA中MGLL mRNA在TCGA數(shù)據(jù)庫的表達(dá)情況；B: 總生存曲線；C: 無瘤生存曲線.

A: FGFR1與MGLL表達(dá)相關(guān)性；B: PIK3CA與MGLL表達(dá)相關(guān)性；C: AKT2與MGLL表達(dá)相關(guān)性；D: GSK3B與MGLL表達(dá)相關(guān)性.

A：Western blot檢測MGLL在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)水平；B：表達(dá)水平的量化結(jié)果；C：Western blot檢測GFP-MGLL在DU145細(xì)胞系中過表達(dá)情況；D，E：DU145和PC3細(xì)胞系中檢測過表達(dá)MGLL對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響. 1)P<0.01

3 討論

近期研究表明，代謝(尤其是脂代謝)與腫瘤的關(guān)系相當(dāng)密切.MGLL又被稱為甘油一脂酶，是一類絲氨酸水解酶[12].MGLL在脂肪組織、卵巢及睪丸中表達(dá)，其協(xié)同激素敏感性脂解酶將三酰甘油分解為脂肪酸及甘油，為細(xì)胞提供能量[13].最近文獻(xiàn)指出，MGLL除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用之外，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮了重要作用.然而MGLL在不同腫瘤中的作用有差異，在有些腫瘤中是抑癌因子，有些腫瘤中是促癌因子.Nomura等[9]的研究首次提出了MGLL在一些侵襲性及原發(fā)性腫瘤中高表達(dá)，比如黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌等，通過脂肪酸能量代謝途徑促進(jìn)腫瘤的生長轉(zhuǎn)移.Joyce等[14]在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)MGLL與EMT的信號分子表達(dá)有相關(guān)性，懷疑MGLL促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可能是通過EMT進(jìn)行.Ye等[15]的研究顯示在結(jié)直腸癌細(xì)胞中敲低MGLL，可以抑制BCL-2和Cyclin D1的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞生長誘導(dǎo)凋亡.但Sun等[11]的研究得出相反結(jié)果，結(jié)直腸癌中過表達(dá)MGLL可通過PI3K/AKT通路抑制腫瘤的生長.MGLL在PCa發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入闡明.Nomura等[16]比較了雄性激素依賴和非依賴的人PCa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MGLL通過大麻素抑制通路和脂肪素促進(jìn)通路，一正一反共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長遷移.本研究通過現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘，對MGLL基因在PCa樣本中的表達(dá)進(jìn)行分析，且通過試驗驗證了MGLL在PCa中的抑癌作用.

本研究分析了公共數(shù)據(jù)庫前列腺正常及癌組織中MGLLmRNA和蛋白表達(dá)情況，探討了其表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系.TCGA和GEO的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，與正常前列腺組織相比，MGLLmRNA水平在PCa中呈低表達(dá).通過THPA發(fā)現(xiàn)MGLL蛋白水平在PCa中同樣低表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果一致.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MGLL的mRNA水平與患者的OS和DFS均存在顯著相關(guān)性，MGLL高表達(dá)的PCa患者其OS和DFS顯著提高.蛋白共表達(dá)相關(guān)性分析表明，MGLL與FGF/PI3K/AKT信號通路密切相關(guān).TCGA數(shù)據(jù)庫的表達(dá)分析表明，MGLL與該通路的關(guān)鍵分子(FGGR1、PIK3CA、AKT2、GSK3B)呈正相關(guān).深入觀察了PCa細(xì)胞系中MGLL的水平，發(fā)現(xiàn)MGLL低表達(dá)；而過表達(dá)MGLL則可顯著抑制PCa細(xì)胞系的遷移和侵襲能力.綜上MGLL是個抑制腫瘤的蛋白，且其發(fā)揮功能可能與PI3K/AKT信號通路相關(guān)，這為進(jìn)一步驗證MGLL參與PCa脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制提供了新的證據(jù).

綜上，本研究通過對前列腺及癌組織中MGLL的深入挖掘與分析，發(fā)現(xiàn)MGLL在PCa樣本中低表達(dá)，并與腫瘤患者預(yù)后相關(guān).數(shù)據(jù)庫大樣本分析可避免研究樣本量過小而造成的誤差，為PCa的基礎(chǔ)研究提供了一定的理論依據(jù)和新的思路.