固相萃取-同位素稀釋-UPLC-MS/MS法檢測茶葉中百草枯和敵草快殘留量

陳健豪

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350002）

百草枯（1,1'-二甲基-4,4'-聯(lián)吡啶陽離子鹽）和敵草快(1,1'-亞乙基-2,2'-聯(lián)吡啶二溴鹽)均為快速滅生性除草劑，具有觸殺作用和一定內(nèi)吸作用，能迅速被植物綠色組織吸收，使其枯死。百草枯與敵草快在土壤中迅速與土壤結(jié)合而鈍化，在農(nóng)業(yè)上廣泛用于茶園、果園中的雜草去除。但是，百草枯對人毒性極大，且無特效解毒藥，口服中毒死亡率極高[1]，已被20多個國家禁止或者嚴(yán)格限制使用。中國自2014年7月1日起撤銷了百草枯水劑登記和生產(chǎn)許可、停止生產(chǎn)，但保留母藥生產(chǎn)企業(yè)水劑出口境外登記、允許專供出口生產(chǎn)，2016年7月1日起停止水劑在國內(nèi)銷售和使用[2]。

我國GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[3]規(guī)定茶葉中百草枯的殘留限量為0.2 mg/kg，但對茶葉中敵草快的限量未做規(guī)定，而實(shí)際上在茶葉種植管理中百草枯和敵草快這2種除草劑都不允許使用。按國標(biāo)GB 2763—2019規(guī)定，百草枯檢測方法為SN/T 0293—2014[4]，敵草快檢測方法為GB/T 5009.221—2008[5]及SN/T 0293—2014。SN/T 0293 —2014標(biāo)準(zhǔn)方法適用于蔬菜、水果等機(jī)體，由于茶葉基質(zhì)非常復(fù)雜，在茶葉檢測中發(fā)現(xiàn)該方法存在檢測靈敏度極低、回收率差等缺點(diǎn)。GB/T 5009.221—2008標(biāo)準(zhǔn)在檢測敵草快時采用氣相色譜法，由于敵草快為強(qiáng)極性不揮發(fā)的物質(zhì)，因此，需要復(fù)雜的衍生和萃取步驟，檢測效率極低。目前，對百草枯和敵草快的檢測方法主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[6～11]，但現(xiàn)有方法在檢測茶葉時往往都存在前處理方法復(fù)雜、不適用、離子抑制強(qiáng)烈、回收率差和定性、定量不準(zhǔn)確等問題，無法達(dá)到快速、靈敏檢測的目的。因此，本方法在已有文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上，對茶葉的前處理方法、分離檢測條件及檢測影響因素等進(jìn)行了詳細(xì)的研究。

1 試驗部分

1.1 試驗儀器

超高效液相色譜儀Waters Acquity UPLC系統(tǒng)配Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國沃特世公司）；20管固相萃取裝置（美國安捷倫公司）；冷凍高速離心機(jī)（美國貝克曼公司，Avanti J-E）；超聲清洗機(jī)（鼎泰（湖北）生化科技設(shè)備制造有限公司，DTC-27J）； Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司，Advantage）；分析天平（賽多利斯北京有限公司，BSA224S）；渦旋混合器（德國IKA公司，MS 3 basic）。

1.2 試劑和材料

水為超純水；甲醇（色譜純，山東禹王）；乙腈（色譜純，山東禹王）；甲酸（GR，德國默克）；鹽酸（AR）、乙酸銨（GR）均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；標(biāo)準(zhǔn)品：二氯百草枯標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%，美國sigma公司）；敵草快二溴鹽標(biāo)準(zhǔn)品（99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；百草枯-D6二碘化物（99.8%，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司）；敵草快-D4同位素內(nèi)標(biāo)（93.7%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；固相萃取柱：PCX 60 mg/3 mL（博納艾杰爾科技有限公司），使用前分別用2 mL甲醇和2 mL 0.5%甲酸溶液活化平衡。

5 mol/L 乙酸銨：稱取38.5 g乙酸銨，加水溶解稀釋到100 mL。

0.5 mol/L 鹽酸：移取20.0 mL鹽酸，加水稀釋到500 mL。

0.5 mol/L 鹽酸∶甲醇=2∶8提取液：取200 mL 0.5 mol/L鹽酸加800 mL甲醇，混勻。

50% 乙腈（含2%甲酸）：250 mL乙腈加250 mL水，再加10 mL甲酸，混勻。

淋洗液：取1.0 mL濃度為5 mol/L乙酸銨溶液，加入4.0 mL水、4.0 mL甲醇和1.0 mL甲酸，混勻。

洗脫液：取4.0 mL濃度為5 mol/L乙酸銨溶液，加入1.0 mL水、4.0 mL甲醇和2.0 mL甲酸，混勻。

標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液配制：分別準(zhǔn)確稱取適量百草枯和敵草快標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L鹽酸∶乙腈=1∶1溶液溶解配成百草枯和敵草快濃度約為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再取適量儲備液用0.1 mol/L鹽酸∶乙腈=1∶1溶液稀釋成約1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于4 ℃冰箱中保存。

分別稱取適量的百草枯-D6和敵草快-D4標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L鹽酸∶乙腈=1∶1溶液溶解配制成約500 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再取適量內(nèi)標(biāo)儲備液用0.1 mol/L鹽酸∶乙腈=1∶1溶液稀釋成約10 μ g/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于4 ℃冰箱中保存；移取適量百草枯和敵草快標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，準(zhǔn)確加入20 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間溶液，用洗脫液稀釋定容至2.0 mL，混勻，配成百草枯和敵草快濃度約為5～250 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度均為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，將標(biāo)準(zhǔn)溶液用移液槍吸入塑料內(nèi)襯管中，置于2 mL樣品瓶中進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.3 樣品處理

稱取5 g（精確到1 mg）粉碎茶葉樣品于50 ml具塞塑料離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)中間液，再加入25.0 mL 0.5 mol/L鹽酸∶甲醇=2∶8提取液，渦旋振蕩混勻，超聲波振蕩提取30 min，10000 r/min 離心3 min。用移液槍移取5.0 mL上清液加入活化后的PCX 60 mg/3 mL固相萃取柱中，流速控制在約1 mL/min，待樣液流盡后，用2 mL50%乙腈（含2%甲酸）、2 mL甲醇和1.0 mL淋洗液依次淋洗，真空抽干，再用1.0 mL洗脫液洗脫于10 mL塑料離心管中，渦旋混勻，移取300 μL洗脫液于塑料內(nèi)襯管中，置于2 mL樣品瓶中進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.4 UPLC-MS/MS 分析條件：

1.4.1 色譜分析條件

表1 特征離子及其他質(zhì)譜參數(shù)

色譜柱：資生堂，Capcell PAK，ST，5 μm，150 mm×2.0 mm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.40 mL/ min；

流動相及梯度：A為20 mmol/L乙酸銨（含0.4%甲酸），B為乙腈，0—1.0 min，30%—50% A；1.0—5.0 min，50% A；5.0—6.5 min，90% A；6.5—8.5 min，30% A。

1.4.2 質(zhì)譜分析條件

電離源：電噴霧正離子模式；毛細(xì)管電壓：4.00 kV；源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；碰撞氣：氬氣，0.40 mL/min；電子倍增管電壓650 V；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測［multi reaction monitoring（MRM）］模式；特征離子及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別取濃度約為1 μg/mL的百草枯和敵草快標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，由注射泵注入質(zhì)譜儀掃描進(jìn)行母離子和子離子的掃描，掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ESI（+）模式下，百草枯同時存在響應(yīng)值相近m/z為186和185的母離子，敵草快母離子m/z為183，百草枯-D6 母離子m/z為192，敵草快-D4母離子m/z為186，通過優(yōu)化錐孔電壓等參數(shù)得到掃描圖（圖1）。

對母離子進(jìn)行子離子掃描，由于百草枯m/z為186和185的母離子都只有一個豐度較大的子離子，其余子離子的響應(yīng)豐度值相比都要小20倍以上，因此，百草枯檢測選擇186＞171離子對為定量離子，選擇185＞170離子對為定性離子，通過優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到百草枯和敵草快及內(nèi)標(biāo)的子離子掃描圖（圖2），最終確定百草枯和敵草快的定量和定性離子對及內(nèi)標(biāo)離子對相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)如“1.4.2”。

圖1 百草枯和敵草快及內(nèi)標(biāo)的一級質(zhì)譜分析圖

圖2 百草枯和敵草快及內(nèi)標(biāo)的二級質(zhì)譜分析圖

2.2 色譜條件優(yōu)化

本方法采用了超高效液相色譜儀，該儀器具有較小體積，且在低流速條件下能夠?qū)μ荻茸兓泻芸斓捻憫?yīng)。

由于百草枯和敵草快都是強(qiáng)極性的物質(zhì)，在C18色譜柱上基本沒有保留，因此，采用適合極性物質(zhì)分離的親水性HILIC色譜柱，實(shí)驗對比了Waters公司的1.7 μm，100 mm×2.1 mm HILIC色譜柱和資生堂公司的Capcell PAK，ST，5 μm，150 mm×2.0 mm色譜柱；同時，比較了0.1%甲酸/乙腈體系、0.5%甲酸/乙腈體系、10 mmol/L乙酸銨/乙腈體系和20 mmol/L乙酸銨/乙腈體系作為流動相的分離效果。實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸/乙腈體系下百草枯和敵草快色譜峰型差且靈敏度低，乙酸銨/乙腈體系能有效改善色譜峰型并提高靈敏度，提高乙酸銨濃度有利于改善峰型，增加響應(yīng)強(qiáng)度，但濃度太高的乙酸銨緩沖鹽容易造成離子源的快速污染，反而影響檢測的靈敏度，因此，本實(shí)驗采用20 mmol/L乙酸銨/乙腈體系做流動相。

針對流動相酸度的影響進(jìn)行了實(shí)驗，結(jié)果表明提高酸度能加快百草枯和敵草快的出峰，有效減小峰展寬，提高峰響應(yīng)值，流動相中加入0.4%甲酸具有最好的分離效果和靈敏度。

圖3 百草枯和敵草快標(biāo)準(zhǔn)品（A）和空白茶葉樣品（B）總離子流圖（TIC）和MRM譜圖

在色譜柱選擇上，雖然Waters公司的1.7 μm超高效色譜柱具有更好的峰型和靈敏度，但該柱難以將百草枯和敵草快分離，而百草枯的定性離子與敵草快存在干擾峰，必須將兩物質(zhì)分離達(dá)到基線分離，實(shí)驗發(fā)現(xiàn)資生堂公司的Capcell PAK，ST色譜柱能將其有效分離，經(jīng)優(yōu)化后的色譜分離圖見圖3。

2.3 前處理條件優(yōu)化

SN/T 0293 —2014標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的檢測方法適用范圍中不包含茶葉，而實(shí)驗過程中也發(fā)現(xiàn)無法正常檢測。這是由于SN/T 0293—2014采用的固相萃取柱PWCX小柱為弱陽離子交換柱，對百草枯和敵草快的吸附不夠強(qiáng)，很容易由于茶葉中的大量雜質(zhì)競爭吸附而解吸，同時樣品中大量的雜質(zhì)也造成離子抑制強(qiáng)烈，因此該凈化方法完全不適用于茶葉樣品。而本研究發(fā)現(xiàn)PCX強(qiáng)陽離子交換柱對百草枯和敵草快有強(qiáng)烈的吸附，通用的PCX柱洗脫劑5%氨水/甲醇溶液無法將其洗脫，因此，可以將大量的樣品雜質(zhì)通過50%乙腈（含2%甲酸）和甲醇等各種淋洗劑去除掉，最后采用較高濃度的酸性乙酸銨/甲醇洗脫溶液1 ml即可有效洗脫百草枯和敵草快。

提取溶液優(yōu)化。百草枯和敵草快均極易溶于水，但茶葉吸水后膨脹非常厲害，并且，高速離心后的上清液中仍然含有大量的膠質(zhì)等懸浮物，在過柱凈化時極易造成堵塞，嚴(yán)重影響凈化效果和回收率。研究發(fā)現(xiàn)增加提取液中甲醇比例能夠有效解決溶脹和堵塞問題，同時，在酸性條件下有利于百草枯和敵草快的電離及在PCX柱上的吸附，因此，實(shí)驗最終采用0.5 N鹽酸∶甲醇=2∶8作為樣品提取溶液。此外，實(shí)驗發(fā)現(xiàn)玻璃材質(zhì)對百草枯和敵草快具有較強(qiáng)的吸附作用，低濃度時甚至被完全吸附，因此，樣品提取、前處理及進(jìn)樣溶液均需采用塑料制備器具與容器。

2.4 線性范圍和檢測限

本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，標(biāo)準(zhǔn)系列只需用樣品洗脫溶液配制即可。在5～250 ng/mL濃度范圍內(nèi)，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），以百草枯和敵草快定量離子峰面積除以內(nèi)標(biāo)峰面積的值與內(nèi)標(biāo)濃度的乘積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在該濃度范圍內(nèi)百草枯和敵草快均具有良好的線性關(guān)系，由10 ng/mL樣品加標(biāo)溶液的峰高與噪音的信噪比計算得到茶葉基質(zhì)中的方法檢測限（3倍噪音）和定量限（10倍噪音）如表2。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對試樣中待測組分進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量，試樣溶液的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍內(nèi)。

表2 百草枯和敵草快的線性方程與檢測限

表3 不同茶葉中百草枯和敵草快的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.5 回收率和精密度試驗

取福建盛產(chǎn)的巖茶、白茶和鐵觀音3種空白茶葉樣品進(jìn)行3個水平的標(biāo)準(zhǔn)添加試驗，每個添加量做6個平行試驗，試驗結(jié)果見表3。該方法對百草枯的回收率在94.6%～103.4%之間，精密度在0.7%～8.0%之間；對敵草快的回收率在99.5%～107.9%之間，精密度在0.5%～5.7%之間?？梢娫摲椒▽Π俨菘莺蛿巢菘炀哂辛己玫幕厥章屎途芏龋m合茶葉的檢測。

3 實(shí)際樣品檢測

采集福建省內(nèi)茶葉企業(yè)生產(chǎn)的巖茶、茉莉花茶、鐵觀音茶、紅茶、白茶和綠茶等茶葉樣品100個批次，采用本方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果敵草快均未檢出，共有16個樣品檢出了百草枯，陽性樣品檢測結(jié)果見表4。

百草枯檢出率為16%，其中最高檢出含量為0.08 mg/kg，均在國標(biāo)GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的限量0.2 mg/kg允許范圍內(nèi)，可見，在國家禁止百草枯農(nóng)藥使用以后，基本上已經(jīng)杜絕了百草枯在茶葉種植中的使用，但由于百草枯與土壤結(jié)合牢固并會不斷釋放出微量的百草枯[12]，因此，前期有使用過百草枯的茶園仍會在一段時間內(nèi)殘留少量的百草枯。

表4 福建省內(nèi)茶企樣品中百草枯陽性樣品檢測結(jié)果（n=3）

4 結(jié)論

本文建立了茶葉中百草枯和敵草快的提取、凈化方法和同位素稀釋-UPLC-MS/MS檢測方法。茶葉樣品經(jīng)高有機(jī)相酸性提取液提取、離心后，使用PCX強(qiáng)陽離子交換小柱固相萃取凈化，去除了茶葉中大量的干擾物質(zhì)，降低了離子抑制的干擾，采用資生堂Capcell PAK，ST親水色譜柱分離后UPLCMS/MS檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。該方法定性、定量準(zhǔn)確，線性范圍寬，靈敏度高，能很好地應(yīng)用于茶葉中百草枯和敵草快的檢測，填補(bǔ)了國標(biāo)方法對茶葉檢測的難題，為相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了有力的技術(shù)支撐。