Townes-Brocks綜合征基因型-表型相關(guān)性分析

嚴(yán)曉虹 袁慧軍 趙宇

作者單位：1 四川大學(xué)華西醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 成都 610041

2 四川大學(xué)華西醫(yī)院罕見病研究院 成都 610041

3 陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心 重慶 400038

Townes-Brocks綜合征(townes-brocks syndrome，TBS)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病。1972年由Townes和Brocks首次描述[1]，目前全球已報(bào)道超過100個(gè)TBS病例，其中我國共報(bào)道8例[2～5]，這些病例表現(xiàn)出TBS在臨床表型上高度的異質(zhì)性。TBS患者的主要臨床特征為肛門閉鎖、耳部發(fā)育不良(如小耳畸形、耳低位、外耳道閉鎖和招風(fēng)耳等)，以及拇指畸形(如軸前多指、拇指三指節(jié)畸形和拇指縱裂等)[6]。

SALL1基因是導(dǎo)致TBS的主要致病基因[7]。雖然SALL1基因敲除的小鼠沒有表現(xiàn)出類似人類TBS的表型，然而SALL1單等位基因缺失的患者可表現(xiàn)出典型的TBS表型，說明單倍劑量不足是SALL1導(dǎo)致TBS的機(jī)制之一[8，9]。同時(shí)，存在SALL1突變?nèi)鏿.Arg276X可以逃避無義介導(dǎo)的衰變(nonsense-mediated decay，NMD)，產(chǎn)生截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)并擾亂正常SALL1蛋白的定位和功能，從而通過顯性負(fù)效應(yīng)的機(jī)制致病[10]。Miller等[8]發(fā)現(xiàn)TBS病人癥狀的嚴(yán)重程度與SALL1是否通過單倍劑量不足的機(jī)制致病沒有明顯相關(guān)性，需要更多的病例、更完整的表型評估和基因數(shù)據(jù)來完善TBS的基因型-表型相關(guān)性的研究。

本文回顧了1998年～2021年1月所有報(bào)道攜帶SALL1變異的TBS病例，以歸納總結(jié)TBS表型譜和SALL1變異譜，對SALL1變異導(dǎo)致的TBS進(jìn)行基因型-表型相關(guān)性分析，為后續(xù)TBS相關(guān)研究提供參考。

1 SALL1基因變異導(dǎo)致TBS的機(jī)制研究現(xiàn)狀

SALL1是對器官發(fā)生至關(guān)重要的進(jìn)化保守基因SALL家族的4個(gè)成員之一，其編碼的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子與組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物NuRD相互作用發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能，并通過SALL1的磷酸化修飾整個(gè)過程[11，12]。

SALL1在小鼠胚胎的腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢芽和心臟發(fā)育過程中表達(dá)，發(fā)揮重要作用。SALL1純合敲除的小鼠通常因出現(xiàn)嚴(yán)重的腎臟發(fā)育不良而死亡，而雜合敲除的小鼠沒有明顯的異常表型[9，13]。SALL1在小鼠腎單位祖細(xì)胞和腎基質(zhì)祖細(xì)胞中表達(dá)，抑制腎單位祖細(xì)胞的分化、維持其干性并以非細(xì)胞自主方式限制腎單位祖細(xì)胞的過度擴(kuò)增，通過在后腎表達(dá)調(diào)節(jié)輸尿管芽的正常分支[7，9，14～16]。Exner等[17]設(shè)計(jì)了缺乏SALL基因的非洲爪蟾模型，發(fā)現(xiàn)SALL1和Sall4通過抑制Pou5f3家族的表達(dá)，以協(xié)調(diào)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。中樞神經(jīng)系統(tǒng)對于SALL1的丟失尤為敏感，經(jīng)典敲除和條件敲除小鼠研究均表明，SALL1影響皮質(zhì)板層的時(shí)間特異性。在沒有SALL1的情況下，在胚胎第18.5天(E18.5)大腦皮層的表面積和深度均減少[15]。基因表達(dá)譜已鑒定出SALL1是神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的特征基因(signature gene)，對于小膠質(zhì)細(xì)胞的成熟、形態(tài)調(diào)節(jié)和特異性的維持尤為重要[13，18，19]。除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，SALL1還在早期發(fā)育階段的晶狀體中高度表達(dá)，維持纖維細(xì)胞和晶狀體的上皮粘附[20]。Morita等[21]發(fā)現(xiàn)SALL1可在未分化的心臟祖細(xì)胞(cardiac progenitor cells，CPC)中表達(dá)，從而驅(qū)動左右心室的發(fā)生，認(rèn)為SALL1標(biāo)記未分化狀態(tài)的CPC，并調(diào)控心臟分化的過程。

在人類中，SALL1的雜合突變可導(dǎo)致TBS，這是一種常染色體顯性發(fā)育異常，其經(jīng)典臨床三聯(lián)征為肛門、拇指和外耳的畸形，且常伴隨其他系統(tǒng)異常，常涉及腎臟和心臟[22，23]。在全球報(bào)道的所有病例中，SALL1變異涉及拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)、移碼突變(frameshift variation)、無義突變(nonsense variation)和剪接變異(splicing variation)。

SALL1導(dǎo)致TBS的機(jī)制主要分為顯性負(fù)效應(yīng)和單倍劑量不足兩種。由于絕大多數(shù)的SALL1變異導(dǎo)致終止密碼子的提前出現(xiàn)，最開始人們推測致病機(jī)制應(yīng)為單倍劑量不足。然而，SALL1雜合敲除的小鼠卻沒有表現(xiàn)出類似TBS的表型[9]。Kiefer等[24]建立了攜帶雜合SALL1-ΔZn2-10突變的小鼠模型，該突變導(dǎo)致SALL1缺乏編碼大部分鋅指結(jié)構(gòu)域的序列，與導(dǎo)致人類TBS的SALL1變異相似。SALL1-ΔZn2-10小鼠表現(xiàn)出了感音神經(jīng)性聾、多囊腎和四肢骨骼發(fā)育異常。另外，翻譯出的截?cái)嗟鞍走€可干擾其他Sall家族蛋白的正常功能的行使。2008年，Kiefer等[10]發(fā)現(xiàn)SALL1-ΔZn2-10小鼠中可導(dǎo)致發(fā)育中的心臟和四肢中兩個(gè)SALL1下游基因Nppa和Shox2的異位激活，并證明SALL1突變c.826C＞T可以產(chǎn)生穩(wěn)定的截?cái)鄊RNA和蛋白質(zhì)(p.R276X)，因此認(rèn)為SALL1主要通過顯性負(fù)效應(yīng)導(dǎo)致人類TBS。Bozal-Basterra等[25，26]進(jìn)一步證明了SALL1p.Pro332Hisfs*10和p.Arg276*導(dǎo)致的截短蛋白可以在人體細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，并通過分離培養(yǎng)TBS患者(TBSp.Pro332Hisfs*10和TBSp.Arg276*)的皮膚成纖維細(xì)胞和鄰近蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測，發(fā)現(xiàn)了截?cái)嗟腟ALL1蛋白可以通過影響初級纖毛調(diào)節(jié)蛋白CCP110、CEP97的正常功能和增加LUZP1的降解，導(dǎo)致細(xì)胞中初級纖毛形態(tài)和生長頻率的異常。研究人員在TBSp.Pro332Hisfs*10成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了SHH通路的異常，推測TBS患者的聽力異常可能是由于SHH通路異常所導(dǎo)致的。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)SALL1基因的雜合和純合敲除小鼠以及攜帶SALL1-ΔZn2-10的小鼠耳蝸長度變短和外毛細(xì)胞數(shù)量減少，首次在TBS小鼠中發(fā)現(xiàn)了耳蝸的異常發(fā)育。

從1999年開始，隨著攜帶SALL1基因CNV的TBS病人的報(bào)道(包括SALL1等位基因的缺失)，人們意識到單倍劑量不足有可能是TBS的致病機(jī)制之一，并通過有限的病例的表型分析推測此類病人的表型比顯性負(fù)效應(yīng)導(dǎo)致的TBS的表型輕微[8，28～33]。Miller等[8]通過文獻(xiàn)回顧和基因型-表型分析發(fā)現(xiàn)上述差異并不成立，存在SALL1拷貝數(shù)變異導(dǎo)致的表型嚴(yán)重的TBS患者。

目前只有極少的SALL1蛋白經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明可以產(chǎn)生穩(wěn)定的截?cái)嗟鞍譡25]，因此其余變異是否逃逸了NMD而產(chǎn)生蛋白，或無法表達(dá)而導(dǎo)致SALL1單倍體不足，仍然需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

2 TBS基因型-表型相關(guān)性分析

筆者回顧了1998年～2021年1月所有報(bào)道了TBS患者SALL1基因變異情況的文獻(xiàn)，希望了解不同位置和不同類型變異導(dǎo)致的TBS臨床表型異質(zhì)性和嚴(yán)重程度的相關(guān)性。根據(jù)人類基因組變異學(xué)會(the Human Genome Variation Society)指南，根據(jù)參考序列NM_002968.3以規(guī)定的格式進(jìn)行總結(jié)。本文回顧共鑒定156個(gè)病例，攜帶71個(gè)不同的SALL1變異，并根據(jù)變異類型和所在的鋅指結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了劃分總結(jié)。

圖1，2總結(jié)了患者的基因型，SALL1的變異類型和所占比例，包括拷貝數(shù)變異、移碼突變、無義突變和剪接變異。移碼突變和無義突變占據(jù)了絕大部分，且無一例外全部導(dǎo)致SALL1基因轉(zhuǎn)錄的提前終止，3例攜帶SALL1剪接變異的患者均為內(nèi)含子內(nèi)的突變，同樣導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的提前終止。在10例攜帶拷貝數(shù)變異的患者中，出現(xiàn)了5例SALL1的單等位基因缺失，3例SALL1附近的片段缺失和1例移碼突變和框內(nèi)大片段缺失的復(fù)合雜合病例。此外，本文還總結(jié)了2例SALL1純合突變(c.3160C＞T純合突變)。

圖1 156例TBS患者基因型總結(jié)

圖2 156例TBS患者變異位點(diǎn)數(shù)量及類型總結(jié)

圖3 突變位置對應(yīng)組別及人數(shù)

表1 攜帶SALL1 致病性變異的TBS 患者概況

另外，還存在3 例嵌合突變的情況[34～36]，包括2 例染色體核型正常的病例和8 號染色體三體型的病例。核型正常的患者中，其中1例(c.1255delT，p.Leu419Cysfs*74)癥狀較輕微，文獻(xiàn)僅記錄患者表現(xiàn)為手部和足部的發(fā)育異常，未報(bào)道外耳、聽力、肛門、泌尿生殖系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)異常等TBS常見臨床表型，另1例(c.1112C＞G，p.Ser371*)患者更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為手部畸形、外耳畸形、感音神經(jīng)性聾、生長發(fā)育遲緩和視力發(fā)育異常等情況。8號染色體三體型的病例[34]同樣表現(xiàn)出典型的TBS表型，伴尿路狹窄、腎功能異常和智力發(fā)育遲緩等癥狀，患者出現(xiàn)了口周、肛周的潰瘍，類似癥狀在其他TBS病例中未報(bào)道[35]。

2.1 SALL1的移碼突變和無義突變位置與TBS表型嚴(yán)重程度相關(guān)

本文根據(jù)TBS患者攜帶的變異類型及變異對應(yīng)的氨基酸位置進(jìn)行了分組和表型總結(jié)，變異對應(yīng)的氨基酸位置處于同一個(gè)鋅指轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域的變異分為同一組(圖3)，表型分類方式參考J.Kohlhase[6]發(fā)表在GeneReviews的文章《Townes-Brocks Syndrome》，將TBS表型分為主要表型、次要表型和其他表型，表1～4總結(jié)了患者的分組情況及各組在主要表型和次要表型上的陽性率。

主要表型包括①肛門畸形；②外耳發(fā)育異常；③手部畸形。次要表型包括①聽力損失；②足部畸形；③泌尿生殖系統(tǒng)畸形；④先天性心臟病。除以上表型以外的臨床表型納入其他表型范圍。

筆者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者的突變(87/136，64.0%)位于A組第65～471位氨基酸之間，這個(gè)區(qū)間的突變導(dǎo)致SALL1基因只保留了1個(gè)完整的鋅指結(jié)構(gòu)域[37]。該組病人中TBS典型表型的陽性率很高，外耳、肛門和手部畸形的陽性率分別達(dá)到了87.06%，76.47%和83.53%，此外，次要表型如聽力損失、足部畸形和泌尿生殖系統(tǒng)異常的陽性率也過半。另外兩組樣本量較多的C組和F組的病人，突變后SALL1基因分別保留了3個(gè)和8個(gè)完整的鋅指結(jié)構(gòu)域。C組的病例的典型表型的陽性率都與A組病人相似，但是F組的陽性率要明顯低于A、C兩組。筆者推測，由于F組保留的鋅指結(jié)構(gòu)域基序更多，能夠更大程度上維持蛋白質(zhì)的正常功能，因此患者癥狀更輕微。Netzer等[38]的研究顯示，SALL1基因有兩個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域，分別位于蛋白質(zhì)的最N端87個(gè)氨基酸區(qū)域和第434～690個(gè)氨基酸之間，失去兩區(qū)域中任意一個(gè)或破壞第434～690個(gè)氨基酸區(qū)域的完整性會明顯降低SALL1的抑制活性，刪除第690個(gè)氨基酸之后的區(qū)域則對抑制活性的影響不大，該研究結(jié)果與A、C組的患者表型較F組嚴(yán)重的情況一致，A、C組的患者存在SALL1關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)編碼區(qū)域的破壞，而F組的患者突變位置所對應(yīng)的蛋白質(zhì)區(qū)域位于關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域之后。

雖然B、D、E組的患者人數(shù)過少，難以進(jìn)行比較，但從以上結(jié)果推測，對于SALL1移碼突變和無義突變導(dǎo)致TBS的患者，突變位置與表型嚴(yán)重程度具有相關(guān)性，位于關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的編碼區(qū)域的突變對SALL1蛋白轉(zhuǎn)錄抑制活性的影響更大，患者的表型更嚴(yán)重。

表2 攜帶SALL1 致病性變異的TBS 患者主要表型總結(jié)

表3 攜帶SALL1 致病性變異的TBS 患者次要表型聽力和腎臟總結(jié)

表4 攜帶SALL1 致病性變異的TBS 患者次要表型心臟、下肢和眼總結(jié)

2.2 SALL1拷貝數(shù)變異

H-M組患者攜帶SALL1或SALL1鄰近區(qū)域的拷貝數(shù)變異。H組9個(gè)病例存在SALL1基因單等位基因缺失，TBS的典型表型和次要表型的陽性率都很高，且有5/9個(gè)病例存在發(fā)育遲緩。Borozdin等[39]報(bào)道了5例存在SALL1拷貝數(shù)變異的病人，認(rèn)為SALL1缺失患者的TBS表型似乎比其他患者更輕微，后經(jīng)Miller等[8]對后續(xù)發(fā)表病例進(jìn)行進(jìn)一步補(bǔ)充報(bào)道和總結(jié)認(rèn)為Borozdin等人的觀點(diǎn)缺少充分證據(jù)支持。I組為Borozdin等[39]報(bào)道的1例SALL1單等位基因部分片段缺失的病人(g.4785579_4788962del)，該CNV導(dǎo)致SALL1的所有雙鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的編碼序列缺失，根據(jù)Netzer等[38]的研究結(jié)果，該病例丟失了一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域。病人表現(xiàn)出典型TBS三聯(lián)征和多系統(tǒng)的異常，包括腎功能損害、膀胱輸尿管返流、足部畸形和眼底異常等。J組的唯一患者攜帶了5號和16號染色體結(jié)構(gòu)變異t(5；16)(p15.3；q12.1)，不清楚斷裂位置是否包含或直接破壞了SALL1的連續(xù)性，該患者除TBS三聯(lián)征以外，文章沒有報(bào)道其他系統(tǒng)的異常。K組和L組的3例患者都只存在SALL1的3’或5’端UTR區(qū)的片段缺失，基因編碼區(qū)本身保留了完整性，但是患者仍表現(xiàn)出典型TBS三聯(lián)征，提示缺失的區(qū)域可能包含重要的調(diào)控序列，對基因的功能有關(guān)鍵調(diào)控作用。

M組的患者攜帶了一個(gè)SALL1 2號外顯子內(nèi)1.1 kb的片段缺失(c.1488_2049del和p.Gln497Argfs*12)，其中只有6 bp的片段保留了下來。Southern blot analysis發(fā)現(xiàn)該變異導(dǎo)致了2號外顯子內(nèi)Hind Ⅲ限制性酶切位點(diǎn)(Hind Ⅲ restriction site)的丟失，并產(chǎn)生了另外的4 kb譜帶。該患者表現(xiàn)出TBS三聯(lián)征、發(fā)育遲緩以及腎臟發(fā)育不良[33]。

2.3 剪接變異總結(jié)

Blanck等[40]報(bào)道了一個(gè)SALL1IVS2-19T＞A突變導(dǎo)致TBS的家系。該家系的3個(gè)患者沒有表現(xiàn)出完整的TBS三聯(lián)征，即肛門、拇指和外耳的畸形、先證者合并有尿道下裂、腎臟發(fā)育不良、腎功能衰竭和房間隔缺損，另外兩個(gè)攜帶同樣突變的親屬都沒有其他系統(tǒng)的異常。

該報(bào)道通過RT-PCR證明了變異產(chǎn)生了與野生型SALL1等量的轉(zhuǎn)錄本，對RT-PCR的片段測序顯示突變SALL1的轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)異常剪接而插入17 bp序列，導(dǎo)致SALL1蛋白過早終止(1208 aa)。說明SALL1致病性變異不止存在于外顯子中，內(nèi)含子的變異也可導(dǎo)致終止密碼子的提前出現(xiàn)，從而導(dǎo)致TBS。提示對于存在TBS表型的患者，如果全外顯子測序未查見SALL1致病性變異，應(yīng)考慮該基因內(nèi)含子區(qū)域是否存在變異。

2.4 TBS存在常染色體隱形遺傳的情況

Vodopiutz等[41]報(bào)道了目前唯一一個(gè)TBS常染色體隱性遺傳的家系。先證者及其妹妹攜帶SALL1c.3160C＞T純合變異，表型包括法洛四聯(lián)癥、多囊腎、圍產(chǎn)期發(fā)生的慢性腎功能衰竭、肢體及外耳畸形、感音神經(jīng)性聾、胼胝體發(fā)育不良、皮質(zhì)性盲和精神運(yùn)動功能完全不發(fā)育(complete lack of psychomotor development)，研究人員將這種表型稱為中樞神經(jīng)系統(tǒng)TBS(central nervous system-townes-brocks syndrome，CNS-TBS)。該家系中11人攜帶SALL1c.3160C＞T雜合變異，除了患者父親存在無需干預(yù)的室間隔缺損外，家族其余成員均健康，無肛門閉鎖、耳聾或腎功能異常的家族史。由于并非家族內(nèi)所有雜合變異的攜帶者都接受了全面的臨床檢測，且不能確定先證者父親的心臟結(jié)構(gòu)異常是否由SALL1雜合變異導(dǎo)致，因此筆者認(rèn)為，尚不能確定CNS-TBS的遺傳模式是常染色體隱性遺傳，有可能是CNS-TBS的不完全外顯導(dǎo)致。同時(shí)Vodopiutz等也發(fā)現(xiàn)SALL1c.3160C＞T(p.Arg1054*)突變能產(chǎn)生少量的截?cái)嗟鞍祝赡鼙Ａ袅瞬糠止δ?，可解釋為什么SALL1c.3160C＞T雜合突變的攜帶者沒有明顯的表型，該推測與Netzer等[38]的研究結(jié)果一致。

F組患者突變位點(diǎn)都位于SALL1c.3160C后，且表型明顯，只是相較于突變位置靠前的患者稍輕微。因此，至少對于位置在關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域?qū)?yīng)編碼區(qū)以外的變異，不能完全根據(jù)突變位置或位點(diǎn)的數(shù)量推測癥狀的嚴(yán)重程度。

3 結(jié)論

筆者對目前報(bào)道的存在SALL1變異的TBS患者進(jìn)行了回顧和基因型-表型相關(guān)性分析，初步得出以下觀點(diǎn)：①位于SALL1關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的編碼區(qū)域的突變與其他位置的突變導(dǎo)致的TBS相比，前者的患者的表型更嚴(yán)重；②突變位于關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的編碼區(qū)域之后的SALL1基因可能維持部分功能，此類雜合突變攜帶者可不出現(xiàn)明顯TBS表型；③至少對于位置在關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域?qū)?yīng)編碼區(qū)以外的變異，不能完全根據(jù)突變位置或位點(diǎn)的數(shù)量推測癥狀的嚴(yán)重程度。

SALL1變異可以通過單倍劑量不足或顯性負(fù)效應(yīng)兩種機(jī)制導(dǎo)致TBS，然而，對絕大部分因SALL1變異導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)的TBS患者而言，其攜帶的變異基因是否能產(chǎn)生穩(wěn)定的截?cái)嗟鞍滓廊徊磺宄?。對這類患者，其表型可能是通過上述兩種機(jī)制中任意一種造成，因此，僅靠變異位點(diǎn)的位置進(jìn)行基因型-表型分析并不全面。

未來，需要建立大樣本的TBS患者隊(duì)列，通過多組學(xué)(如轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等)結(jié)合的方法全面地研究患者體內(nèi)不同的SALL1基因變異的表達(dá)情況和與健康對照在分子層面的差異，才能進(jìn)一步闡明不同基因型與表型之間的相關(guān)性，并探索相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)的變化，以明確SALL1變異導(dǎo)致TBS的致病機(jī)制。