吸附劑針對(duì)性凈化-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定油茶果中55種持久性有機(jī)污染物

沈丹玉，袁新躍，王 蕤，王若輝，鄭悅雯，吳書天， 劉毅華，莫潤(rùn)宏，鐘冬蓮，湯富彬

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400； 2.杭州市富陽(yáng)區(qū)食品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江 杭州 311400)

持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants, POPs)是一類對(duì)人類健康和環(huán)境具有嚴(yán)重危害的天然或者人工合成的有機(jī)污染物質(zhì)。POPs具有“三致性”，即致癌、致畸、致突變；同時(shí)還具有半揮發(fā)性，在環(huán)境中極難降解，能夠在大氣環(huán)境中長(zhǎng)距離遷移而在全球范圍內(nèi)擴(kuò)散，使得POPs污染不僅是區(qū)域性問(wèn)題，也是一個(gè)全球性的環(huán)境問(wèn)題[1-2]。國(guó)際社會(huì)為了淘汰和削減POPs的生成和排放，保護(hù)環(huán)境和人類免受其危害，2001年5月22日聯(lián)合國(guó)通過(guò)了《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》[3]。常見(jiàn)的POPs有多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)、多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)和有機(jī)氯農(nóng)藥(organochlorine pesticides, OCPs)等。其中，PCBs是人工合成的有機(jī)物，在工業(yè)上用作熱載體、絕緣油和潤(rùn)滑油，全世界生產(chǎn)和應(yīng)用的PCBs遠(yuǎn)超過(guò)100萬(wàn)噸，其中已有1/4至1/3進(jìn)入人類環(huán)境，造成危害[4]；PAHs主要來(lái)自人類工業(yè)生產(chǎn)和生活等方面的人為來(lái)源，包括原油類在使用或運(yùn)輸過(guò)程中的泄露、焦化過(guò)程中的煤炭燃燒、石油等化石燃料的不完全燃燒、農(nóng)作物秸稈焚燒、薪柴燃燒等[5]；OCPs因殺蟲(chóng)效果顯著曾被廣泛使用，盡管現(xiàn)在已停止生產(chǎn)和使用，但由于其持久性和難降解性，可以在環(huán)境介質(zhì)(土壤、沉積物、水體、植被等生物體)中存留數(shù)十年或者更長(zhǎng)時(shí)間，并且通過(guò)生物富集[6]。POPs具有疏水性、親脂性和富集性，易于在環(huán)境中長(zhǎng)期殘留，并可通過(guò)食物鏈累積和放大[7-8]。

油茶是世界四大木本油料之一，是我國(guó)特有的油料樹(shù)種。研究油茶果不同部位有害污染物的含量是對(duì)油茶籽和油茶籽油進(jìn)行質(zhì)量安全評(píng)價(jià)的前提?，F(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)GB5009.190—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中指示性多氯聯(lián)苯含量的測(cè)定》和GB5009.265—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多環(huán)芳烴的測(cè)定》均指明了適用于動(dòng)物性食品和油脂類試樣中指示性PCBs測(cè)定和食品中PAHs測(cè)定的方法，不涉及油料作物。目前，國(guó)內(nèi)外POPs研究的對(duì)象主要集中在大氣、水體、土壤和沉積物等環(huán)境類樣品，以及肉類、蛋類、水產(chǎn)品等動(dòng)物性食品[9-12]，植物性樣品的POPs檢測(cè)報(bào)道相對(duì)較少[13-15]，而油茶籽POPs檢測(cè)方法的報(bào)道只有苯并(a)芘[16]和18種PCBs[17]。由于油茶樣品富含油脂、各種植物色素、皂素和蛋白質(zhì)，其基質(zhì)復(fù)雜，故將POPs從油茶果樣品中分離富集出來(lái)是決定分析結(jié)果可靠性的重要前提。

近年來(lái)，氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)技術(shù)已逐步應(yīng)用于痕量有機(jī)物的分析[18-19]。本研究擬比較不同吸附劑對(duì)油茶果不同部位的針對(duì)性凈化效果，采用GC-MS/MS法測(cè)定油茶籽仁、油茶外種皮和油茶殼中55種POPs，希望為油茶果及其他油料作物的POPs檢測(cè)提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及材料

7000B QQQ氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；T18高速均質(zhì)機(jī)：德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；Biofuge Stratos冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；HCG-24A氮吹濃縮儀：天津恒奧科技公司產(chǎn)品；DMT2500多管漩渦混合儀：上海圣科儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CPA225D分析天平：德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品。

油茶果樣品：2018年11月采自湖南、江西、浙江3個(gè)油茶主產(chǎn)省份。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1油茶籽仁中POPs的提取與凈化 稱取10 g磨碎的油茶籽仁樣品于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈均質(zhì)1 min，再加入2 g NaCl，以2 500 r/min多管漩渦混合2 min，5 000 r/min離心5 min。分取5 mL上清液于已加入300 mg無(wú)水MgSO4、100 mg PSA、100 mg C18和3～7 mg NANO Carb的10 mL離心管中，以2 500 r/min多管漩渦混合2 min，10 000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移2.5 mL凈化上清液于40 ℃下氮?dú)獯蹈桑? mL正己烷定容，加入20 μL環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)溶液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.2.2油茶外種皮和油茶殼中POPs的提取與凈化 稱取10 g磨碎的油茶外種皮或油茶殼樣品于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈均質(zhì)1 min，再加入2 g NaCl，以2 500 r/min多管漩渦混合2 min，5 000 r/min 離心5 min。分取5 mL上清液于已加300 mg無(wú)水MgSO4、100 mg PSA(或100 mg C18，100 mg Florisil，100 mg Si，100 mg SCX，20 mg NANO Carb，50 mg Pesticarb)的10 mL離心管中，以2 500 r/min多管漩渦混合2 min，10 000 r/min 離心5 min。轉(zhuǎn)移2.5 mL凈化上清液于40 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL正己烷定容，加20 μL環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)溶液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 準(zhǔn)確吸取0.50 mL多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)溶液、1.00 mL多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)溶液、10 mL有機(jī)氯標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，正己烷定容，配制成2～25 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(其中，α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、六氯苯、毒殺芬和滅蟻靈為2 mg/L，α-硫丹和β-硫丹為20 mg/L，異狄氏劑為25 mg/L，其他45種POPs為10 mg/L)，4 ℃保存。再分別吸取0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶，正己烷定容，配制成梯度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存，備用。

準(zhǔn)確稱取30 mg環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)物于10 mL容量瓶中，正己烷定容，配制成 3 000 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存，備用。

每個(gè)梯度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL，添加20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，搖勻上機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 HP-5MS 毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度70 ℃，保持2 min，以25 ℃/min升溫至150 ℃，再以3 ℃/min升溫至200 ℃，最后以8 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)，流速2.4 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。

裂縫貫穿7#橋臺(tái)，其下方緊鄰6#橋墩，無(wú)論發(fā)生何種破壞，將直接對(duì)7#橋臺(tái)的基礎(chǔ)產(chǎn)生破壞，若發(fā)生側(cè)向滑移(塌)，則直接對(duì)6#橋墩造成破壞，都會(huì)直接導(dǎo)致大橋損毀，高速斷道，直徑經(jīng)濟(jì)損失巨大，社會(huì)影響嚴(yán)重。

1.3.2質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源，電離能量 70 eV，離子源溫度 230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度 280 ℃，溶劑延遲 5 min，燈絲電流100 μA。分別對(duì)55種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全掃描，以化合物的最大m/z作為母離子；接著調(diào)用product方法，優(yōu)化碰撞電壓，以m/z最大和次大的子離子作為定性離子，m/z最大的子離子為定量離子；最后根據(jù)各化合物的出峰順序、母離子和子離子的m/z、碰撞電壓等參數(shù)建立多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，具體參數(shù)列于表1。定量方法為峰面積內(nèi)標(biāo)法。55種持久性有機(jī)污染物的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖1。

表1 55種持久性有機(jī)污染物的保留時(shí)間、定量及定性離子對(duì)、碰撞電壓Table 1 Retention time, qualitative ions, quantitative ions and collision energy of 55 POPs

續(xù)表1

注：化合物1～55同表1圖1 55種持久性有機(jī)污染物的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of 55 POPs by GC-MS/MS

2 結(jié)果與分析

2.1 針對(duì)性凈化效果比較

圖2 吸附劑凈化油茶籽仁、 外種皮和油茶殼的效果對(duì)比Fig.2 Comparison for the clean-up effects of camellia seed kernel, episperm and shell extracts by adsorbents targeted purification

采用不同吸附劑對(duì)油茶果各部位提取液進(jìn)行凈化，外觀效果示于圖2。油茶籽仁提取液未經(jīng)凈化(k0)時(shí)呈黃色；前期研究確定600 mg無(wú)水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA和5 mg NANO Carb聯(lián)合凈化油茶籽提取液能夠得到滿意的效果，并且18種多氯聯(lián)苯的回收率可以滿足要求。在此基礎(chǔ)上，本研究采用300 mg無(wú)水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA(k1)凈化，提取液變?yōu)闇\黃色；再分別添加3 mg(k2)、4 mg(k3)、5 mg(k4)、6 mg(k5)、7 mg(k6) NANO Carb聯(lián)合凈化，提取液均為無(wú)色透明。

油茶外種皮提取液未經(jīng)凈化(e0)時(shí)呈深黃色；經(jīng)100 mg C18(e2)、100 mg SCX(e5)和100 mg Si(e4)凈化，提取液均變淺；經(jīng)100 mg Florisil(e3)和100 mg PSA(e1)凈化，提取液為淺黃綠色；經(jīng)20 mg NANO Carb(e6)凈化，提取液顏色明顯變淺；經(jīng)50 mg Pesticarb(e7)凈化，提取液接近無(wú)色。

油茶殼提取液未經(jīng)凈化(s0)時(shí)呈紅褐色；經(jīng)100 mg C18(s2)和100 mg Si(s4)凈化，提取液均變成深黃色；經(jīng)100 mg Florisil(s3)、20 mg NANO Carb(s6)和50 mg Pesticarb(s7)凈化后，提取液均變淺；經(jīng)100 mg SCX(s5)凈化，提取液接近無(wú)色；經(jīng)100 mg PSA(s1)凈化，提取液變?yōu)闊o(wú)色透明。

油茶籽仁含有大量的脂肪，樣品共提物中含有色素、蛋白質(zhì)等大分子干擾物質(zhì)，從外觀凈化結(jié)果看，向300 mg無(wú)水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA中添加3～7 mg NANO Carb對(duì)油茶籽仁提取液的凈化效果較好。油茶果皮含有大量色素、鞣質(zhì)和皂苷，比較幾種吸附劑對(duì)油茶果皮提取液的凈化外觀，50 mg Pesticarb凈化效果最好。油茶殼含有茶皂素、多糖、蛋白質(zhì)等，100 mg PSA對(duì)油茶殼提取液的凈化效果較好。

2.2 線性關(guān)系、檢出限與定量限

對(duì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積相對(duì)值和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到55種POPs標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限，結(jié)果列于表2。55種POPs在各自的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，除Phe、p,p′-DDD、p,p′-DDT和Bbf的相關(guān)系數(shù)為0.992 1～0.994 5外，其他51種POPs的相關(guān)系數(shù)為0.995 0～0.999 9，其中有23種POPs的相關(guān)系數(shù)大于0.999。16種多環(huán)芳烴檢出限為2.17～65.5 μg/kg；低、中環(huán)多環(huán)芳烴除NaP、BaA、Chr、An和Flu分別為17.34、11.85、9.11、6.31和6.72 μg/kg外，其余5種檢出限均在2.17～2.57 μg/kg之間；6種高環(huán)多環(huán)芳烴檢出限為30.61～65.50 μg/kg。18種多氯聯(lián)苯檢出限為0.69～4.75 μg/kg，定量限為2.29～15.82 μg/kg；其中PCB105、PCB126和PCB189定量限分別為13.18、14.48、15.82 μg/kg，其他15種多氯聯(lián)苯定量限均低于8.13 μg/kg。21種多氯聯(lián)苯檢出限為0.18～22.35 μg/kg，定量限為0.58～74.52 μg/kg；其中狄氏劑、β-硫丹、α-硫丹、異狄氏劑和順-氯丹的定量限較高，分別為74.52、52.06、37.29、20.64、12.29 μg/kg；毒殺芬、滅蟻靈、艾氏劑和p,p′-DDE的定量限較低，分別為0.58、0.84、1.31、1.41 μg/kg；其余12種多氯聯(lián)苯定量限為2.82～7.56 μg/kg。

2.3 加標(biāo)回收率

分別對(duì)油茶籽仁、外種皮和油茶殼進(jìn)行55種POPs加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，選擇5、25、250 μg/kg 3個(gè)添加水平，做3次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均回收率，結(jié)果示于圖3。從圖3a可知，油茶籽仁提取液采用300 mg無(wú)水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA(k1)凈化，55種POPs的回收率為75.3%～148.3%，其中有33種化合物的回收率為80%～120%；分別添加3 mg(k2)、4 mg(k3)、5 mg(k4)、6 mg(k5)、7 mg(k6) NANO Carb聯(lián)合凈化，回收率在80%～120%范圍內(nèi)的化合物有37、43、46、49、40種。因此，確定采用300 mg無(wú)水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA和6 mg NANO Carb對(duì)油茶籽仁提取液進(jìn)行聯(lián)合凈化，除BghiP回收率為69.1%，Nap、BaA、Bbf和Inp回收率為70.4%～75.6%，DaA回收率為121.0%外，其他49種化合物的回收率均在80%～120%之間。

表2 55種持久性有機(jī)污染物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LOD and LOQ of 55 POPs

續(xù)表2

圖3 油茶籽仁(a)、外種皮(b)和油茶殼(c)中55種持久性有機(jī)污染物的添加回收率(n=3)Fig.3 Spiked recoveries of 55 POPs in camellia seed kernel (a), episperm (b) and shell (c)(n=3)

從圖3b可知，油茶外種皮提取液經(jīng)100 mg PSA(e1)、100 mg C18(e2)、100 mg Florisil(e3)、100 mg Si(e4)、100 mg SCX(e5)、20 mg NANO Carb(e6)和50 mg Pesticarb(e7)凈化，回收率在80%～120%范圍內(nèi)的化合物分別有42、35、26、29、25、22、25種，100 mg PSA回收率較好，100 mg C18次之，20 mg NANO Carb和50 mg Pesticarb凈化條件下分別有16、14種化合物的回收率低于70%，表明20 mg NANO Carb或50 mg Pesticarb對(duì)部分化合物存在吸附作用。而按照?qǐng)D2的色素凈化外觀呈現(xiàn)，50 mg Pesticarb凈化效果最佳，其次為20 mg NANO Carb，再次為100 mg PSA。因此，兼顧回收率和色素凈化，選擇300 mg無(wú)水MgSO4、100 mg PSA、20 mg Pesticarb對(duì)油茶外種皮提取液進(jìn)行凈化，55種POPs的回收率在75.9%～138.2%之間，其中有44種化合物的回收率在80%～120%范圍內(nèi)。

從圖3c可知，油茶殼提取液經(jīng)100 mg PSA(s1)、100 mg C18(s2)、100 mg Florisil(s3)、100 mg Si(s4)、100 mg SCX(s5)、20 mg NANO Carb(s6)和50 mg Pesticarb(s7)凈化，回收率在80%～120%范圍內(nèi)的化合物分別有46、25、21、25、36、23、34種，100 mg PSA回收率最好，100 mg SCX(s5)和50 mg Pesticarb回收率次之，剛好與之前的凈化外觀效果一致。因此，確定采用300 mg無(wú)水MgSO4和100 mg PSA對(duì)油茶殼提取液進(jìn)行凈化，回收率為78.2%～135.5 %。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

將本方法應(yīng)用于來(lái)自湖南、江西和浙江3個(gè)省份54份油茶樣品分離后的油茶籽仁、油茶外種皮和油茶殼中55種POPs的檢測(cè)，代表性油茶籽仁樣品的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖4。 三省份不同產(chǎn)區(qū)的油茶果樣品中POPs檢測(cè)結(jié)果經(jīng)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行均值比較，結(jié)果示于圖5。可見(jiàn)，油茶籽仁檢出較高的POPs為NaP、狄氏劑、Fl、毒殺芬、Phe、α-BHC和Ace，檢出含量分別為(566.26±105.94)、(204.88±43.04)、(14.03±0.52)、(13.75±0.69)、(13.75±0.52)、(13.05±3.34)、(4.36±0.34) μg/kg。油茶外種皮檢出率較高的POPs為NaP、Fl、Phe、毒殺芬、α-BHC和Ace，檢出含量分別為(1 109.43±118.17)、(10.93±0.41)、(9.97±0.42)、(9.63±0.61)、(7.30±2.00)、(3.62±0.26) μg/kg。油茶殼檢出率較高的POPs為NaP、毒殺芬、Fl和Phe，檢出含量分別為(703.57±123.73)、(7.03±0.66)、(6.03±0.38)、(5.13±0.37) μg/kg。

圖4 油茶籽仁代表性樣品55種持久性有機(jī)污染物的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of 55 POPs in representative camellia seed kernel by GC-MS/MS

圖5 油茶果結(jié)構(gòu)和55種持久性有機(jī)污染物的檢出分布Fig.5 Structure of camellia oleifera fruit and the detection and distribution of 55 persistent organic pollutants

其中，Nap含量為油茶外種皮(1 109.43 μg/kg)>油茶殼(703.57 μg/kg)>油茶籽仁(566.26 μg/kg)，是具有2個(gè)苯環(huán)的低環(huán)PAHs，由于蒸氣壓較高，主要分布在氣相中，因此推測(cè)油茶Nap污染主要來(lái)自環(huán)境大氣；Ace、Fl、Phe含有3個(gè)苯環(huán)，F(xiàn)lu具有4個(gè)苯環(huán)，3～4個(gè)苯環(huán)的PAHs在氣相和固相中均有分布，推測(cè)污染來(lái)源為環(huán)境中的大氣和土壤，3～4環(huán)的多環(huán)芳烴在油茶籽仁中高于油茶殼和外種皮，進(jìn)一步驗(yàn)證了多環(huán)芳烴具有親脂性，容易在富含油脂的油茶籽仁進(jìn)行富集。狄氏劑、七氯和毒殺芬為持久性接觸和胃毒殺蟲(chóng)劑，可防治地下害蟲(chóng)及蟻類，用作土壤殺蟲(chóng)劑的艾氏劑是環(huán)境中狄氏劑(高達(dá)97%)的主要來(lái)源，當(dāng)土壤含有豐富有機(jī)質(zhì)時(shí)，艾氏劑能很快被土壤吸收并反應(yīng)產(chǎn)生狄氏劑。

3 結(jié)論

建立了針對(duì)性凈化與GC-MS/MS相結(jié)合的方法測(cè)定油茶果不同部位中55種持久性有機(jī)污染物。通過(guò)比較不同吸附劑，確定PSA、C18和NANO Carb用于油茶籽仁的凈化，PSA和Pesticarb用于油茶外種皮的凈化，PSA用于油茶殼的凈化，方法學(xué)參數(shù)驗(yàn)證良好。將該方法應(yīng)用于實(shí)際樣品測(cè)定，平行性和準(zhǔn)確度好，靈敏度高，適用于油茶果不同部位持久性有機(jī)污染物的檢測(cè)，對(duì)其他油料作物的持久性有機(jī)污染物檢測(cè)有一定的參考價(jià)值。