超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜測(cè)定大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)及其在電離輻射腦損傷動(dòng)物模型中的應(yīng)用

孟憲雙，白 樺，馬 強(qiáng)，馬 宏，鄧玉林

(1.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

神經(jīng)遞質(zhì)(neurotransmitter)在機(jī)體信息傳導(dǎo)和調(diào)控生理機(jī)能方面發(fā)揮著重要作用。乙酰膽堿是20世紀(jì)上半葉第一個(gè)被確定為神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)[1]。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，現(xiàn)代生物化學(xué)一般將神經(jīng)遞質(zhì)分為單胺類、氨基酸類、肽類及其他類，其中單胺類和氨基酸類是主要的神經(jīng)遞質(zhì)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括兒茶酚胺和吲哚胺兩大類，兒茶酚胺包括多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素，吲哚胺主要指5-羥色胺；氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)包括γ-氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸、組胺及乙酰膽堿。有研究證實(shí)某些神經(jīng)遞質(zhì)的失調(diào)或紊亂與多種神經(jīng)性病理過(guò)程密切相關(guān)，如阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)、帕金森氏病(Parkinson's disease, PD)以及成癮(adduction)、抑郁癥(depression)和精神分裂(schizophrenia)等[2-4]。因此，高效測(cè)定生物樣本中的神經(jīng)遞質(zhì)濃度及其變化，在神經(jīng)生理學(xué)研究、疾病的預(yù)測(cè)和診斷、藥物質(zhì)量控制等方面都有著重要意義。

生物樣本基質(zhì)復(fù)雜，而神經(jīng)遞質(zhì)含量較低(納摩爾級(jí))，因此，內(nèi)源性成分往往對(duì)其測(cè)定造成較大干擾，是生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域的難題。近年來(lái)，有研究人員采用多種檢測(cè)技術(shù)，如化學(xué)修飾電極直接檢測(cè)[5-12]、高效液相色譜/毛細(xì)管電泳-電化學(xué)法[13-17]、熒光成像法[18-19]、液相色譜-質(zhì)譜法[20-23]測(cè)定不同組織樣本中的神經(jīng)遞質(zhì)等物質(zhì)。其中，電化學(xué)法的靈敏度低、穩(wěn)定性不佳，且修飾電極的使用壽命較短；熒光成像技術(shù)中常用的熒光探針大多為有機(jī)染料分子，其光穩(wěn)定性不強(qiáng)、靈敏度低，且存在光漂白等缺點(diǎn)，在一定程度上限制了熒光成像技術(shù)的發(fā)展；近紅外熒光成像技術(shù)的靈敏度高，且可實(shí)時(shí)成像，但受檢測(cè)深度的限制，僅能做表面或近表面分析；色譜-質(zhì)譜技術(shù)因分離效率高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)成為生物樣本重要的檢測(cè)手段。近年來(lái)，高分辨質(zhì)譜由于高選擇性、可提供精確質(zhì)量數(shù)、靈敏且數(shù)據(jù)可回溯等優(yōu)勢(shì)，已成為分析領(lǐng)域的重要檢測(cè)技術(shù)。

本研究擬采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)技術(shù)，建立一種基于精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)和高分辨二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)匹配的方法，用于快速、靈敏地分析血清中神經(jīng)遞質(zhì)，以蛋白沉淀法進(jìn)行大分子沉淀及目標(biāo)成分的萃取，對(duì)方法的提取回收率、線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、稀釋效應(yīng)及殘留效應(yīng)等進(jìn)行考察，并將本方法初步應(yīng)用于電離輻射致腦損傷大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量的測(cè)定及變化的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

UltiMate 3000超高效液相色譜儀(配有二元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱)、Q Exactive靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(配有ESI源)：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；XS105分析天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；MS2渦旋振蕩器：德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；YM-080S超聲儀：深圳市方奧微電子有限公司產(chǎn)品；CR 21G高速冷凍離心機(jī)：日本Hitachi公司產(chǎn)品。

多巴胺(CAS:51-61-6)、5-羥色胺(CAS:50-67-9)、腎上腺素(CAS:51-43-4)、5-羥吲哚乙酸(CAS:54-16-0)、乙酰膽堿(CAS:51-84-3)、去甲腎上腺素(CAS:51-41-2)、甘氨酸(CAS:56-40-6)、天冬氨酸(CAS:56-84-8)、谷氨酸(CAS:56-86-0)、γ-氨基丁酸(CAS:56-12-2)標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于99.0%，分別購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司、德國(guó)Dr. Ehrestorfer公司和美國(guó)AccuStandard公司；甲醇、乙腈和甲酸：LC-MS級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；超純水：由美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)的MILLI-Q50超純水機(jī)制得。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取適量的每種神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，用65%乙腈-水溶解制得100 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別精密量取1 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相定容，配制成10 mmol/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-20 ℃保存，分析前在4 ℃冰箱中自然解凍。

1.3 動(dòng)物處理及血清采集

24只雄性遠(yuǎn)交群(SD)大鼠(體重200～250 g)：購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，隨機(jī)分為對(duì)照組(8只)和輻照組(16只)，輻照組再平均分成2組，分別以10 Gy和30 Gy劑量進(jìn)行Co60-γ射線腦部照射，劑量率為2.519 4 Gy/min，適應(yīng)性飼養(yǎng)30天后處死。

將全部大鼠稱重，并腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/1 kg體重)進(jìn)行麻醉；待麻醉后約20 min，將大鼠以仰臥位固定于木板上，用環(huán)形鉗夾住大鼠頸部及左右腹股溝，環(huán)形鉗手柄套固定于鐵釘，大鼠即固定好；打開胸腔，將心臟暴露，用注射器(實(shí)驗(yàn)前用EDTA溶液浸潤(rùn))以心臟穿刺法進(jìn)行取血。將血置于滅菌的離心管中，室溫下凝固1～2 h(如凝血效果不好，可放置4 ℃冰箱中過(guò)夜，使血液充分凝固)，4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，分裝并標(biāo)記好，在-80 ℃黑暗條件下保存。

1.4 血清樣本預(yù)處理

精密吸取100 μL樣本至1.5 mL EP離心管中，加入400 μL蛋白沉淀劑工作溶液(0.1%甲酸-乙腈溶液，使用前在-20 ℃預(yù)冷1 h)，渦旋30 s，冰水浴中超聲15 min，-20 ℃黑暗條件下沉淀過(guò)夜，4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液，氮?dú)獯蹈桑?00 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶，待分析。

1.5 質(zhì)量控制溶液的制備

精密量取5 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS, 10×)于50 mL容量瓶中，加入超純水，定容至刻度，配制成PBS溶液(1×)，然后加入2.5 g牛血清白蛋白(BSA)，混勻，作為空白血清模擬液使用。分別稀釋空白血清模擬液配制低(LQC)、中(MQC)、高(HQC)3個(gè)濃度的質(zhì)量控制(質(zhì)控)樣本，即分別為不高于定量限濃度3倍的低濃度質(zhì)控樣本，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍中部附近的中濃度質(zhì)控樣本，以及標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍上限75%～95%處的高濃度質(zhì)控樣本。處理方式同1.4節(jié)，用于提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)等考察。

1.6 實(shí)驗(yàn)條件

1.6.1色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B)；進(jìn)樣量2 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.5 min(5%B)，1.5～4.0 min(5%～40%B)，4.0～5.0 min(40%～95%B)，5.0～6.0 min(95%B)，6.0～6.1 min(95%～5%B)，6.1～8.0 min(5%B)。

1.6.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；噴霧電壓3.5 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣壓力2.76×105Pa；干燥氣流速0.66 L/min；干燥氣溫度350 ℃；采集模式：數(shù)據(jù)依賴性全掃描(Full-scan MS/dd-MS2)。一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如下：質(zhì)量掃描范圍m/z50～500；分辨率70 000；自動(dòng)增益控制(AGC target)1×106；離子最大注入時(shí)間(maximum IT)100 ms。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如下：分辨率17 500；歸一化碰撞能量(normalized collision energy)20、40、60 eV；自動(dòng)增益控制1×105；離子最大注入時(shí)間50 ms；動(dòng)態(tài)排除(dynamic exclusion)時(shí)間6 s；響應(yīng)強(qiáng)度最高的離子數(shù)目(Top N)為5。神經(jīng)遞質(zhì)的保留時(shí)間及加合離子等信息列于表1，提取離子流色譜圖示于圖1。

1.7 精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)和二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)的建立

按照1.6節(jié)條件進(jìn)行神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的采集，記錄保留時(shí)間并保存二級(jí)質(zhì)譜圖。將每種化合物的名稱、分子式、分子質(zhì)量、CAS編號(hào)、離子化方式、一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)(m/z)、1～2個(gè)特征二級(jí)碎片離子、保留時(shí)間導(dǎo)入TraceFinder軟件，建立精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)；將采集的每種化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖導(dǎo)入mzVault譜圖管理軟件，建立高分辨二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 空白血清模擬液的選擇

由于待測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)均屬于血清中內(nèi)源性成分，很難找到空白血清樣本。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇與血清pH值接近的磷酸鹽緩沖液作為基質(zhì)，加入牛血清白蛋白模擬血清中存在的蛋白質(zhì)等大分子，其濃度設(shè)置參考文獻(xiàn)[24]。

2.2 預(yù)處理方法的優(yōu)化

大鼠血清成分復(fù)雜，含豐富的蛋白質(zhì)、磷脂等內(nèi)源性物質(zhì)，通常需要預(yù)處理。目前，血清的處理方法主要包括液-液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)、固相萃取法(solid phase extraction, SPE)和蛋白沉淀法(protein precipitation, PPT)。其中，LLE法對(duì)血清樣本具有一定的純化能力，但提取效果易受取樣位置高低的影響，對(duì)極性小分子的萃取效率較低；SPE法需特殊裝置，過(guò)程繁瑣；PPT法相對(duì)簡(jiǎn)單，快速高效，且容易實(shí)現(xiàn)高通量。

本實(shí)驗(yàn)中，神經(jīng)遞質(zhì)的辛醇-水分配系數(shù)(logKow)均小于1.5，極性較大。因此，精密吸取100 μL 100 nmol/L的質(zhì)控樣本，選擇常見的極性溶劑，如乙腈(MeCN)、甲醇(MeOH)、0.1%甲酸-乙腈(0.1%FA-MeCN)、0.1%甲酸-甲醇(0.1%FA-MeOH)、甲醇-乙腈(50∶50,V/V)和甲醇-乙腈(25∶75,V/V)進(jìn)行PPT法處理比較，示于圖2。結(jié)果表明，對(duì)多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素、5-羥吲哚乙酸、去甲腎上腺素及谷氨酸的萃取效果，乙腈優(yōu)于甲醇；對(duì)乙酰膽堿、甘氨酸、天冬氨酸及γ-氨基丁酸的萃取效果，乙腈和甲醇相差無(wú)幾；不同體積比例混合的甲醇-乙腈體系的萃取效果不同，在乙腈中添加0.1%甲酸的萃取效果優(yōu)于甲醇-乙腈體系。綜合考察，選擇0.1%甲酸-乙腈作為蛋白沉淀劑。

表1 神經(jīng)遞質(zhì)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table 1 Analysis parameters of neurotransmitters

注：a.多巴胺；b.5-羥色胺；c.腎上腺素；d.5-羥吲哚乙酸；e.乙酰膽堿； f.去甲腎上腺素；g.甘氨酸；h.天冬氨酸；i.谷氨酸；j.γ-氨基丁酸圖1 10種神經(jīng)遞質(zhì)的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of ten neurotransmitters

2.3 數(shù)據(jù)庫(kù)和譜庫(kù)的快速精準(zhǔn)鑒定

以血清中乙酰膽堿為例，首先，TraceFinder軟件根據(jù)設(shè)置的參數(shù)，進(jìn)行一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)(m/z146.117 55)提取，窗口為5×10-6；第二，針對(duì)保留時(shí)間，如果誤差在±3SD范圍內(nèi)，則認(rèn)為該項(xiàng)匹配成功；第三，比較實(shí)驗(yàn)測(cè)得的同位素峰分布圖與理論圖譜(由輸入的分子式計(jì)算得出)，得分超過(guò)90則認(rèn)為匹配較好；第四，將輸入數(shù)據(jù)庫(kù)中的2個(gè)特征碎片離子與實(shí)驗(yàn)采集獲得的2個(gè)碎片離子進(jìn)行比對(duì)，如果實(shí)驗(yàn)值與數(shù)據(jù)庫(kù)中碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差不超過(guò)5×10-6，則認(rèn)為匹配成功；第五，將采集的二級(jí)質(zhì)譜圖與譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得分大于50則認(rèn)為匹配程度較高。當(dāng)上述5項(xiàng)關(guān)鍵參數(shù)全部比對(duì)成功，則可認(rèn)定目標(biāo)物檢出，結(jié)果示于圖3。

圖2 血清中10種神經(jīng)遞質(zhì)的沉淀劑考察結(jié)果(n=6)Fig.2 Optimization results of the precipitants for 10 neurotransmitters in serum (n=6)

注：a.精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間；b.同位素峰分布； c.二級(jí)質(zhì)譜圖和特征碎片離子；虛線框代表特征碎片離子圖3 乙酰膽堿的精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù) 和二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)的鑒定Fig.3 Identification of acetylcholine using the home-made accurate mass database and MS/MS spectra library

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率 采用空白血清模擬液分別配制6批次低、中、高濃度的神經(jīng)遞質(zhì)溶液，按1.4節(jié)方法處理，記錄各神經(jīng)遞質(zhì)的儀器響應(yīng)強(qiáng)度A，用來(lái)模擬空白血清經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)添加和預(yù)處理后的神經(jīng)遞質(zhì)響應(yīng)值；將空白血清模擬液按照1.4節(jié)方法處理后，標(biāo)準(zhǔn)添加神經(jīng)遞質(zhì)，配制6批次低、中、高濃度(濃度與前者相同)的溶液，記錄每種待測(cè)物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度B，用來(lái)模擬空白血清經(jīng)預(yù)處理，再經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)添加的神經(jīng)遞質(zhì)響應(yīng)值；分別采用65%乙腈-水配制6批次低、中、高濃度(濃度與前者相同)的神經(jīng)遞質(zhì)溶液，記錄每種待測(cè)物的響應(yīng)強(qiáng)度C，代表純?nèi)軇┲写郎y(cè)物的響應(yīng)值。本實(shí)驗(yàn)提取回收率(extraction recovery, ER)和基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)的計(jì)算方法為：ER=A/B×100%，ME=B/C×100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2?？梢姡崛』厥章试?3.6%～104.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6%～10.6%，滿足生物樣本的分析要求；基質(zhì)效應(yīng)為62.4%～112.2%，RSD為1.9%～10.1%，表明該方法存在基質(zhì)效應(yīng)，且對(duì)多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。為補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用空白血清模擬液基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

2.4.2線性關(guān)系、檢出限及定量限 采用至少7個(gè)濃度水平的神經(jīng)遞質(zhì)溶液進(jìn)行線性回歸，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，樣品濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行加權(quán)最小二乘法回歸計(jì)算，權(quán)重系數(shù)為1/x2。結(jié)果表明，在各自線性范圍內(nèi)，每種神經(jīng)遞質(zhì)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99；檢出限及定量限分別為0.07～12.81 nmol/L和0.12～25.61 nmol/L，列于表3。該方法的線性范圍寬、靈敏度高，能夠滿足生物樣本的分析要求。

表2 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果(n=6)Table 2 Experiment results of extraction recovery and matrix effect (n=6)

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性范圍、檢出限及定量限結(jié)果Table 3 Results of standard working curve, linear range, limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs)

2.4.3穩(wěn)定性考察 本實(shí)驗(yàn)采用低、中、高濃度溶液進(jìn)行穩(wěn)定性考察，主要包括以下方面：標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液的穩(wěn)定性(4 ℃黑暗條件下放置1個(gè)月，測(cè)定3次)、凍融循環(huán)穩(wěn)定性(質(zhì)控樣品經(jīng)3個(gè)凍融循環(huán))、短期穩(wěn)定性(處理后的血清樣本在自動(dòng)進(jìn)樣器中15 ℃條件下放置24 h)以及長(zhǎng)期穩(wěn)定性(血清樣本于-80 ℃放置3個(gè)月)。采用準(zhǔn)確度(REC)表示實(shí)測(cè)結(jié)果與真實(shí)濃度值之間的差異，以RSD表示同一份樣本多次分析測(cè)定結(jié)果間的接近程度，結(jié)果列于表4?？梢姡?、中、高濃度的溶液在4 ℃條件下放置1個(gè)月的準(zhǔn)確度為-3.8%～9.5%，測(cè)定精密度RSD為0.1%～8.1%；3次凍融循環(huán)的REC值為0.3%～9.7%，RSD為0.1%～8.5%；處理后的血清樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中15 ℃條件下放置24 h的REC值為-8.2%～9.2%，RSD為0.3%～7.5%；血清樣品于-80 ℃條件下放置3個(gè)月的REC值為-8.6%～9.8%，RSD為1.1%～9.9%。以上結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液、質(zhì)控樣品及血清樣本的穩(wěn)定性可滿足生物樣品的分析要求

表4 血清中神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 4 Results of stability for neurotransmitters in serum

。

2.4.4稀釋效應(yīng)和殘留效應(yīng) 稀釋效應(yīng)(dilution effect)指將確定高濃度的生物樣本進(jìn)行一定倍數(shù)稀釋后，測(cè)定濃度與理論濃度比較后的準(zhǔn)確度和精密度，二者應(yīng)在±15%范圍內(nèi)才能確保稀釋的可靠性，其結(jié)果列于表5。經(jīng)10倍稀釋后，準(zhǔn)確度為5.1%～10.6%，精密度RSD值為1.1%～5.3%，均在±15%范圍內(nèi)。

表5 稀釋效應(yīng)及殘留效應(yīng)考察結(jié)果Table 5 Results of dilution effect and carry-over effect

在生物樣品分析方法評(píng)價(jià)中，當(dāng)線性范圍的最高濃度樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣后，須分析空白溶劑或空白樣品以評(píng)估殘留效應(yīng)(carry-over effect, COE)，其可允許接受的范圍應(yīng)不超過(guò)定量限的20%。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)連續(xù)3次進(jìn)樣每種物質(zhì)線性范圍最高濃度的質(zhì)量控制樣本，然后進(jìn)樣分析空白溶劑(初始流動(dòng)相)，評(píng)估本方法的殘留效應(yīng)。在高濃度樣品連續(xù)3次進(jìn)樣后分析初始流動(dòng)相，殘留神經(jīng)遞質(zhì)的峰面積與其在定量限濃度樣本中的峰面積比值在0.4%～4.6%之間，符合分析方法評(píng)價(jià)要求。

2.5 在電離輻射致腦損傷大鼠血清中的應(yīng)用

將建立的分析方法初步應(yīng)用于Co60-γ射線電離輻射致腦損傷大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的研究。根據(jù)本課題組前期工作的基礎(chǔ)[25]，本實(shí)驗(yàn)綜合考察0～50 Gy劑量對(duì)大鼠的影響，結(jié)果表明，大鼠在10、30 Gy兩個(gè)劑量輻照下30天時(shí)，胸腺和脾臟的臟器指數(shù)均發(fā)生了明顯變化，故以此作為本實(shí)驗(yàn)的大鼠輻照劑量。輻照后，大鼠血清中天冬氨酸、乙酰膽堿、去甲腎上腺素、腎上腺素和甘氨酸的含量變化示于圖4。5種神經(jīng)遞質(zhì)均表現(xiàn)出不同程度的下降，說(shuō)明經(jīng)電離輻射致腦損傷后，某些神經(jīng)遞質(zhì)可能作為潛在的生物標(biāo)志物。本工作還需深入開展研究，如加大樣本數(shù)量、考察輻射劑量率及不同飼養(yǎng)時(shí)間等。

注：a.天冬氨酸；b.乙酰膽堿；c.去甲腎上腺素； d.腎上腺素；e.甘氨酸圖4 大鼠血清中5種神經(jīng)遞質(zhì)經(jīng)輻照后的變化情況Fig.4 Changes of five neurotransmitters in rat serum after irradiation

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-HRMS結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)和二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)，建立了血清中10種神經(jīng)遞質(zhì)的快速測(cè)定方法，采用蛋白沉淀法高效萃取目標(biāo)化合物。使用空白血清模擬液(PBS+BSA)基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量分析，補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。方法經(jīng)提取回收率、線性關(guān)系、檢出限、定量限、穩(wěn)定性、稀釋效應(yīng)及殘留效應(yīng)等方面考察，滿足生物樣本的分析要求。此外，基于本方法的Co60-γ射線輻照動(dòng)物模型的研究結(jié)果為篩選急性電離輻射致腦損傷血清中生物標(biāo)志物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。