7 種十字花科植物揮發(fā)物成分分離與鑒定

馮雪夢(mèng)，閆喜中，郝 赤

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷030801）

植物在不斷生長(zhǎng)的同時(shí)，會(huì)持續(xù)地向環(huán)境中釋放揮發(fā)性有機(jī)物，它是植物重要的信息傳遞渠道，對(duì)植物與植物、植物與動(dòng)物間的聯(lián)系起著十分重要的作用。植物揮發(fā)物是植物的次生代謝物，由相對(duì)分子質(zhì)量100～200 的物質(zhì)組成[1]，主要以萜類、苯丙酸類、脂肪酸衍生物和氨基酸衍生物為主[2]。植物揮發(fā)物具有高度的特異性，這種特異性的實(shí)現(xiàn)途徑主要有2 種，一是源于植物中的特異性物質(zhì)，二是植物中的各物質(zhì)按特定比例組成[3]。這使得植食性昆蟲能夠準(zhǔn)確地尋找到寄主植物[4]，如十字花科植物釋放的特異性揮發(fā)物異硫氰酸酯類物質(zhì)可以吸引小菜蛾（Plutella xylostella）、菜粉蝶（Pieris rapae）等昆蟲的取食；蘋果蠹蛾（Cydia pomonella）對(duì)棗樹組織揮發(fā)物有明顯的電生理反應(yīng)[5]。對(duì)于植物本身來(lái)說，通過釋放植物揮發(fā)物，可以抵御病蟲害，吸引天敵昆蟲，甚至可以引起鄰近植物的防御反應(yīng)[6]，從而達(dá)到自我保護(hù)的目的，如歐洲山芥（Barbarea vulgaris）的植物揮發(fā)物可以吸引小菜蛾產(chǎn)卵，但在蓮座期卻對(duì)幼蟲具有強(qiáng)烈的致死作用[7]；玉米花粉釋放的揮發(fā)物可以吸引粉虱的天敵——東亞小花蝽和淺黃恩蚜小蜂，從而減少自身受侵害的程度[8]。此外，植物揮發(fā)物也是食物風(fēng)味的重要體現(xiàn)[9]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，某些植物香味對(duì)人體健康有積極的作用，如提神靜氣、強(qiáng)身健體等[10]，百合科（Liliaceae）植物的揮發(fā)物可凈化空氣，緩解緊張[11]。本試驗(yàn)的研究對(duì)象十字花科植物是人類食用率最高的植物，同時(shí)也受到了嚴(yán)重的蟲害威脅。有研究顯示，十字花科植物至少遭受了5 個(gè)目昆蟲的危害[12]，這些昆蟲靈敏的嗅覺系統(tǒng)，可以使觸角短暫暴露在多種揮發(fā)物質(zhì)混合的空氣中識(shí)別出相關(guān)的寄主氣味線索[13]，從而在復(fù)雜的環(huán)境中找到十字花科植物，并作為取食、交配和產(chǎn)卵的場(chǎng)所。隨著現(xiàn)代生物化學(xué)以及先進(jìn)的生測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)于植物揮發(fā)物的研究會(huì)更加深入。

目前，關(guān)于十字花科植物揮發(fā)物的研究多為對(duì)一種植物的揮發(fā)物成分的研究，缺少對(duì)多種十字花科植物的揮發(fā)物成分差異比較。為了更為全面地分析十字花科植物的揮發(fā)物成分，本研究利用頂空收集的方式，通過氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，對(duì)十字花科7 種植物的揮發(fā)物進(jìn)行收集與鑒定，探討7 種植物的揮發(fā)物組成與含量的差異，利用植物—植食性昆蟲—天敵三級(jí)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系為十字花科病蟲害的進(jìn)一步研究提供一定依據(jù)，從而在研發(fā)綠色農(nóng)藥、降低物種抗性、維持生態(tài)平衡等方面起到重要作用，對(duì)于深入探究植物本身的價(jià)值以及防治植物病蟲害有著重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試7 種十字花科植物為盆栽小白菜（Brassica chinensisL.）、油菜（Brassica napusL.）、芥菜（Brassica junceaL.）、蘿卜（Raphanus sativusL.）、菜心（Brassica campestrisL.）、甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.）、花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytisL.），品種分別為臺(tái)灣小白菜、五月慢、光頭芥、三尺白、49-19 菜心、中甘十一、白雪80，所有植物種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站，均采用生長(zhǎng)21～28 d且長(zhǎng)勢(shì)一致的健康植株進(jìn)行采集工作。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)物的收集 采用頂空收集的方法進(jìn)行7 種十字花科植物揮發(fā)物的收集，具體方法[14]為：選擇晴朗無(wú)風(fēng)的晴天進(jìn)行揮發(fā)物的收集，將提前用蒸餾水清洗好的植株葉片進(jìn)行采集，用消毒后的剪刀將葉片剪碎后迅速裝入采樣瓶中，植物葉片裝至采樣瓶2/5 處，塞緊瓶塞。試驗(yàn)前需進(jìn)行Porapak Q 吸附劑（CNW Technologies）的激活：將20 mg 吸附劑裝入潔凈干燥的采樣管（長(zhǎng)12 cm、內(nèi)徑4 mm、外徑6 mm）中，分別用3 mL 丙酮、3 mL 甲醇進(jìn)行淋洗，用錫箔紙對(duì)采樣管外管壁進(jìn)行包裹。通過硅膠管（圖1）將大氣采樣儀（QS-Ⅱ型，流量為0.5 L/min）、活性碳管、變色硅膠管、玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)、采樣瓶連接起來(lái)，確保裝置的氣密性。抽氣15 min 排盡裝置中的氣體后，再連接采樣管和末端的玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)。采集時(shí)間為4 h。

揮發(fā)物采集結(jié)束后，于常溫下用二氯甲烷洗脫至2 mL 的進(jìn)樣瓶中，每次300 μL 洗脫5 次，密封好后將樣品置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 植物揮發(fā)物成分測(cè)定 采用Trace ISQ 質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)7 種十字花科植物的揮發(fā)物進(jìn)行分析鑒定。色譜柱型號(hào)為DB-5MS，每次進(jìn)樣1 μL，采用不分流進(jìn)樣方式，載氣為氦氣。升溫程序：初始值50 ℃保持2 min，然后以4 ℃/min 的速度升溫到120 ℃保持2 min，再以20 ℃/min 升溫到250 ℃保持4 min，共運(yùn)行32 min。電離方式EI，轟擊電壓為70 eV，檢測(cè)器溫度300 ℃，離子源溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，掃描速度5 s，掃描范圍為45～500 m/z。

樣品按照上述進(jìn)樣條件進(jìn)行揮發(fā)物成分分析，得到的總離子流色譜圖與NIST 8 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，得出化合物結(jié)構(gòu)，從而確定揮發(fā)物組分。各化合物相對(duì)含量的計(jì)算采用峰面積歸一化法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 7 種十字花科植物揮發(fā)物成分鑒定

經(jīng)GC-MS 檢測(cè)，7 種十字花科植物的揮發(fā)物成分總離子色譜如圖2 所示，扣除本底空氣中所含有的雜質(zhì)，共鑒定出萜烯、酯、醛、酮、醇、烴類等81 種化合物（表1），其中，小白菜共鑒定出24 種化合物，主要成分為順-3- 己烯醇、順-3- 己烯乙酸酯、1- 戊烯-3- 醇、乙基苯，占化合物總含量的63.57%；油菜共鑒定出25 種化合物，主要成分為順-3- 己烯醇、1- 戊烯-3- 醇、3- 己烯醛、正己醇，占化合物總含量的71.08%；芥菜共鑒定出17 種化合物，主要成分為異硫氰酸烯丙酯、順-3- 己烯醇、異硫氰酸丁酯、反式-3- 己烯-1- 醇乙酸酯，占化合物總含量的72.47%；蘿卜共鑒定出12 種化合物，主要成分為二十七烷、順-3- 己烯醇、順-3- 己烯乙酸酯、間二甲苯，占化合物總含量的59.62%；菜心共鑒定出17 種化合物，主要成分為順-3- 己烯醇、間二甲苯、二十七烷，占化合物總含量的52.98%；甘藍(lán)共鑒定出27 種化合物，主要成分為異硫氰酸烯丙酯、桉葉油醇、異龍腦，占化合物總含量的50.32%；花椰菜共鑒定出27 種化合物，主要成分為對(duì)二甲苯、乙基苯、順-3- 己烯醇、十一烷，占化合物總含量的38.96%。

表1 7 種十字花科植物葉揮發(fā)物成分分析鑒定結(jié)果

續(xù)表1

2.2 7 種十字花科植物揮發(fā)物成分種類及差異性比較

根據(jù)GC-MS 結(jié)果，7 種十字花科植物揮發(fā)物種類有萜烯、酯、醛、酮、醇、烴類等，且相對(duì)含量存在著明顯的差異（圖3）。其中，酯、醛、醇、烷烴、芳香烴在7 種植物的揮發(fā)物中都被檢測(cè)到，而萜烯類僅在小白菜、甘藍(lán)、花椰菜中被檢測(cè)到，酮類在小白菜、油菜、菜心、甘藍(lán)、花椰菜中被檢測(cè)到。小白菜共有7 類化合物，其中，萜烯類1 種（0.39%）、酯類6 種（14.91%）、醛類5 種（4.18%）、酮類1 種（0.21%）、醇類4 種（46.19%）、烷烴類1 種（1.89%）、芳香烴類5 種（5.72%）；油菜共有6 類化合物，其中，酯類2 種（0.42%）、醛類6 種（5.35%）、酮類2 種（0.14%）、醇類7 種（68.13%）、烷烴類1 種（0.80%）、芳香烴類7 種（1.88%）；芥菜共有5 類化合物，其中，酯類5 種（47.12%）、醛類1 種（0.04%）、醇類3 種（26.26%）、烷烴類4 種（1.17%）、芳香烴類3 種（5.33%）；蘿卜共有5 類化合物，其中，酯類2 種（7.69%）、醛類1 種（0.20%）、醇類1 種（17.03%）、烷烴類4 種（32.13%）、芳香烴類3 種（11.18%）；菜心共有5 類化合物，其中，酯類6 種（8.93%）、酮類2 種（1.12%）、醇類1 種（34.65%）、烷烴類7 種（13.61%）、芳香烴類2 種（14.08%）；甘藍(lán)共有7 類化合物，其中，萜烯類3 種（1.39%）、酯類6 種（34.44%）、醛類1 種（0.09%）、酮類4 種（13.58%）、醇類8 種（35.38%）、烷烴類1 種（0.09%）、芳香烴類4 種（2.07%）；花椰菜共有7 類化合物，其中，萜烯類1種（2.13%）、酯類6 種（8.76%）、醛類1 種（0.29%）、酮類3 種（3.06%）、醇類3 種（5.83%）、烷烴類8 種（6.70%）、芳香烴類6 種（34.93%）。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，7 種十字花科植物小白菜、油菜、芥菜、蘿卜、菜心、甘藍(lán)、花椰菜的揮發(fā)物分別有24、25、17、12、17、27、27 種，酯類、醇類、烷烴類、芳香烴類的化合物含量較高，說明這幾類物質(zhì)是構(gòu)成十字花科植物揮發(fā)物的主要成分；7 種植物的揮發(fā)物都含有綠葉氣味順-3- 己烯醇，且含量較大，在芥菜、蘿卜、甘藍(lán)中鑒定出了特異性化合物異硫氰酸酯類物質(zhì)。

總體來(lái)說，7 種十字花科植物揮發(fā)物的種類、含量等都有一定的差別，這也是造成不同種十字花科植物具有不同風(fēng)味的原因之一，同時(shí)也會(huì)影響植食性昆蟲取食嗜好性，如田間試驗(yàn)中小菜蛾對(duì)小白菜、油菜、芥菜、蘿卜、菜心、甘藍(lán)、花椰菜的產(chǎn)卵量依次減少[15]，分析其主要原因除植物葉片的外觀有所差異外，7 種寄主植物揮發(fā)物對(duì)雌蟲的吸引力有所不同，導(dǎo)致產(chǎn)卵具有差異性。在關(guān)于十字花科植物揮發(fā)物的研究中，戴建青等[16]利用頂空- 固相微萃?。℉P-SPME）的方法鑒定出甘藍(lán)、白菜和青菜的揮發(fā)物中烷烴、烯烴的含量最高；用吹掃法進(jìn)行白菜、羽衣甘藍(lán)、芥藍(lán)、青花菜、芥菜和大白菜揮發(fā)物的收集，并在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)樣品中均含有硫苷降解產(chǎn)物異硫氰酸鹽和腈類化合物[17]；LIU 等[18]對(duì)12 種不同十字花科蔬菜中揮發(fā)性有機(jī)物的含量進(jìn)行測(cè)定，鑒定出44 種揮發(fā)性有機(jī)化合物，且白菜的揮發(fā)性有機(jī)物含量高，蘿卜的揮發(fā)性有機(jī)物含量相對(duì)較低，異硫氰酸酯類物質(zhì)在蘿卜和甘藍(lán)中含量較高，其他蔬菜次之。這些研究與本試驗(yàn)的結(jié)果基本相同，但是也有一定的差異。有研究表明，植物揮發(fā)物成分的鑒定結(jié)果與植物葉片的狀態(tài)、生長(zhǎng)期、收集到的揮發(fā)物的濃度、環(huán)境中CO2的濃度、光照、溫度等因素有著十分密切的關(guān)系[19]。AGELOPOULOS 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，完整甘藍(lán)的揮發(fā)物有α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、1，8- 桉葉素、乙酸正己酯、乙酸順-3- 己烯-1- 酯和三硫化二甲酯，機(jī)械損傷的甘藍(lán)揮發(fā)物中則增加了反式-2- 己烯醛和1- 甲氧基-2- 戊酮，菜青蟲咬食后，則發(fā)現(xiàn)了異硫氰酸酯類物質(zhì)；黃宇萍[21]也研究發(fā)現(xiàn)，被蟲害誘導(dǎo)的甘藍(lán)植株揮發(fā)物種類高于機(jī)械損傷與完整植株，小菜蛾取食后，青菜的揮發(fā)物釋放量增加了3 倍[22]；溫度對(duì)葛根（Pueraria lobata）揮發(fā)物中異戊二烯排放的影響較大，溫度升高10 ℃會(huì)導(dǎo)致異戊二烯排放速率增加8 倍；JASONI 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，高CO2濃度下，洋蔥葉揮發(fā)物2- 十一烷酮和2- 十三烷酮的釋放量增加。相關(guān)研究表明，CO2濃度的改變會(huì)直接影響葉片光合作用和氣孔導(dǎo)度，從而間接影響植物釋放的化合物[24-25]；高揚(yáng)等[26]比較了不同生長(zhǎng)時(shí)期波姬紅無(wú)花果的揮發(fā)物成分，結(jié)果表明，不同月份成熟的果實(shí)揮發(fā)物成分發(fā)生變化。除此之外，植物品種的不同也會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)物成分具有差異[27]。本研究將十字花科較為常見的7 種植物揮發(fā)物進(jìn)行了收集與鑒定，較為全面地總結(jié)分析了7 種植物揮發(fā)物成分含量與種類的不同，揮發(fā)物之間的差異可能是導(dǎo)致蔬菜具有不同風(fēng)味的原因，同時(shí)也成為植物吸引昆蟲的嗅覺線索。

植物揮發(fā)物對(duì)植物與植食性昆蟲、天敵昆蟲的關(guān)系起著至關(guān)重要的作用[28]；利用植物信息化合物調(diào)控昆蟲行為，可以用于解決植物病蟲害問題、保護(hù)生態(tài)平衡、增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等，為降低農(nóng)業(yè)病蟲害提供了新思路，實(shí)現(xiàn)了生態(tài)與經(jīng)濟(jì)效益的雙贏，為生產(chǎn)綠色無(wú)公害的生物農(nóng)藥提供了依據(jù)。