益生木質(zhì)纖維素對雞盲腸黏膜免疫屏障的影響

溫 曌，武笑天，楊 玉

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

家禽生長由于受環(huán)境（如熱應(yīng)激、有害氣體刺激）和營養(yǎng)應(yīng)激等因素的影響，很容易損傷腸道屏障，導(dǎo)致腸道黏膜病變，抵抗力下降，造成腸道菌群失衡紊亂進(jìn)而引發(fā)各種疾病進(jìn)而降低其生產(chǎn)性能，甚至導(dǎo)致死亡[1]。目前，蛋雞集約化養(yǎng)殖日糧特點為高能量、高蛋白、低纖維，這種營養(yǎng)特點也導(dǎo)致了腸炎問題。而膳食纖維被營養(yǎng)學(xué)界認(rèn)定為第七類營養(yǎng)素，它能夠改善許多慢性腸道炎癥疾病，在參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中占據(jù)著重要地位。有研究表明[2]，代謝性炎癥的形成是由于過度營養(yǎng)攝入和新陳代謝所導(dǎo)致體內(nèi)炎癥因子和內(nèi)毒素水平的升高，可增強(qiáng)多種炎癥分子的表達(dá)和活性，增加血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）的表達(dá)。益生木質(zhì)纖維素是由奧地利開發(fā)的一種由新鮮木材為原料制備而成的木質(zhì)纖維素，作為高質(zhì)量的日糧纖維應(yīng)用于動物營養(yǎng)中[3]。跟傳統(tǒng)纖維來源相比，益生木質(zhì)纖維素是可發(fā)酵和不可發(fā)酵膳食纖維的同源混合物?？偵攀忱w維（TDF）88%，其中，粗纖維含量為59%，可溶性膳食纖維含量為1.3%，中性洗滌纖維（NDF）含量為78%，酸性洗滌纖維（ADF）含量為64%，木質(zhì)素含量為25%～30%，這類纖維可以發(fā)揮日糧纖維的最大功效。由于其纖維含量極高，添加較低水平的益生木質(zhì)纖維素（1.0%～1.5%）就能夠?qū)仪莸南^程產(chǎn)生積極影響[4]，增加經(jīng)濟(jì)回報9%以上。因此，在家禽日糧中添加益生木質(zhì)纖維素可以保持能量和營養(yǎng)水平的平衡，而不需要對飼料配方進(jìn)行重大調(diào)整。張慶茹等[5]研究表明，日糧中添加菊粉能顯著提高雛雞的胸腺免疫器官指數(shù)。LING 等[6]研究表明，高的粗纖維水平可降低雛鵝空腸絨毛高度，提高盲腸絨毛高度與隱窩深度之比。FAN 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，豬飲食中補(bǔ)充15%黏性瓜爾豆膠（GG）或可溶性膳食纖維高直鏈玉米抗性淀粉（RS）可以促進(jìn)IL-10mRNA 的表達(dá)，但不會增加促炎細(xì)胞因子TNF-a和IL-6mRNA 的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)結(jié)腸、減少結(jié)腸炎發(fā)生的目的。

目前，國內(nèi)外對盲腸黏膜免疫屏障影響的研究主要對嚙齒類動物、豬和人進(jìn)行了探討，但是針對雞的研究鮮有報道。本試驗通過添加不同水平的益生木質(zhì)纖維素，研究其對不同品種雞盲腸組織形態(tài)、黏液層厚度、盲腸相關(guān)炎癥基因表達(dá)的影響，以評價益生木質(zhì)纖維素和品種對2 種雞盲腸黏膜免疫屏障的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取9 周齡、體質(zhì)量相近的健康邊雞和伊莎褐雞各108 只。益生木質(zhì)纖維素（OptiCell）(批號：17000461) 由北京九州互聯(lián)農(nóng)牧科技有限公司提供，總膳食纖維（TDF）含量為88%，其中，粗纖維含量為59%、可溶性膳食纖維含量為1.3%、中性洗滌纖維（NDF）含量為78%、酸性洗滌纖維（ADF）含量為64%、木質(zhì)素含量為25%～30%。飼料原料購自山西太谷縣石羊飼料公司。

1.2 試驗設(shè)計

2017 年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院科研工作站進(jìn)行試驗。采用2 因素3 水平試驗因子設(shè)計，在育成期（9～20 周），按不同生長階段的營養(yǎng)要求，自行配制益生木質(zhì)纖維素含量不同、等能等蛋白的飼料（表1），益生木質(zhì)纖維素含量設(shè)3 個水平（OF 組為對照，不添加益生木質(zhì)纖維素，OL 和OH 組分別添加2%和4%的益生木質(zhì)纖維素），各處理設(shè)6 個重復(fù)，每個重復(fù)6 只雞。預(yù)試期1 周，正試期11 周。試驗采用立體3 層籠養(yǎng)，每籠3 只雞，自由飲水和采食，及時清糞，保證通風(fēng)，其他均按常規(guī)方式飼養(yǎng)。

表1 9～20 周育成期飼料的營養(yǎng)成分

1.3 測定指標(biāo)及方法

在試驗第20 周末，從每個重復(fù)選1 只與相應(yīng)處理平均體質(zhì)量相近、禁食12 h 的雞，空腹稱質(zhì)量?？谇环叛讱⒑髣冸x腸道，稱法氏囊、脾臟、胸腺免疫器官質(zhì)量。將左盲腸段放入固定液中固定，其余盲腸段轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 免疫器官指數(shù)的計算 免疫器官指數(shù)＝免疫器官質(zhì)量（g）/雛雞活質(zhì)量（g）×100%。

1.3.2 盲腸結(jié)構(gòu)組織形態(tài)測定 將盲腸樣品固定于4%多聚甲醛4 h，按照常規(guī)方法制作病理石蠟切片，脫水、固定、HE 染色，最后在顯微鏡下觀察其變化，每張組織切片選擇絨毛完整無損且走向直的5 個視野來測定絨毛高度和隱窩深度。用Image-Pro Plus 軟件測量絨毛高度等，取平均值。

1.3.3 盲腸黏液層厚度測定 將右盲腸段放入Carnoy 固定液和無水甲醇中固定，且4 ℃存儲。待進(jìn)行石蠟包埋后通過阿利新藍(lán)- 過碘酸雪夫試劑（AB-PAS）進(jìn)行染色。切片經(jīng)AB-PAS 染色之后，酸性黏液物質(zhì)呈藍(lán)色，糖原、中性黏液物質(zhì)呈紅色，混合性黏液物質(zhì)呈藍(lán)紫色或紫藍(lán)色[8]。在普通光鏡下，用Image-Pro Plus 軟件測量各組黏液層的厚度，每個標(biāo)本隨機(jī)選取5 處，測定黏液層厚度，取平均值。

1.3.4 盲腸免疫基因表達(dá)測定 用Trizol 試劑提取盲腸總RNA，檢測RNA 濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，以合成的cDNA 為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明，在實時熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，共50 個循環(huán)，退火60 ℃34 s；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。將β-actin 作為本試驗的內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCt法計算TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1、MUC2mRNA 相對表達(dá)量。利用Primer-BLAST 設(shè)計引物，合成引物如表2 所示。

表2 目的基因引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，按2 因素3 水平試驗設(shè)計分析品種、添加水平的主效應(yīng)和交互作用，采用F檢驗進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生木質(zhì)纖維素與不同品種對免疫器官指數(shù)的影響

由表3 可知，不同品種對脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)無顯著影響（P＞0.05），但對胸腺免疫器官指數(shù)有極顯著影響（P＜0.01），且邊雞胸腺免疫器官指數(shù)極顯著高于伊莎褐雞。益生木質(zhì)纖維素對脾臟、胸腺、法氏囊免疫器官指數(shù)均無顯著影響（P＞0.05）。品種和益生木質(zhì)纖維素交互作用對脾臟、胸腺、法氏囊免疫器官指數(shù)的影響均不顯著（P＞0.05）。

表3 益生木質(zhì)纖維素和不同品種對免疫器官指數(shù)的影響

2.2 益生木質(zhì)纖維素和不同品種對盲腸組織形態(tài)的影響

表4 益生木質(zhì)纖維素和不同品種對盲腸組織形態(tài)的影響

由表4 可知，不同品種對絨毛高度（V）、隱窩深度（C）和絨隱比（V/C）均無顯著影響（P＞0.05）。益生木質(zhì)纖維素對V 和V/C 均無顯著影響（P＞0.05），但對C 有極顯著影響（P＜0.01），且OL 和OF 組極顯著低于OH 組（圖1）。品種和益生木質(zhì)纖維素交互作用對V、C 和V/C 無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 益生木質(zhì)纖維素和不同品種對盲腸黏液層厚度的影響

由表5 可知，不同品種和益生木質(zhì)纖維素對黏液層厚度均有極顯著影響，伊莎褐雞盲腸黏液層厚度極顯著高于邊雞（P＜0.01），OL 組極顯著高于OH組（P＜0.01）。品種和益生木質(zhì)纖維素交互作用對盲腸黏液層厚度有顯著影響，且伊莎褐雞OL 組顯著高于其他各組（P＜0.05）（圖2）。

表5 益生木質(zhì)纖維素和不同品種對盲腸黏液層厚度的影響

2.4 益生木質(zhì)纖維素和不同品種對盲腸相關(guān)炎癥基因、MUC2 的影響

從表6 可以看出，不同品種對MUC2 mRNA 相對表達(dá)量有極顯著影響（P＜0.01），伊莎褐雞的MUC2 mRNA 表達(dá)量極顯著高于邊雞。添加益生木質(zhì)纖維素對IL-1、TNF-α、IL-10、IL-6、MUC2 mRNA 相對表達(dá)量有顯著影響，OL 和OH 組促炎性細(xì)胞因子IL-1mRNA 相對表達(dá)量顯著低于OF 組（P＜0.05），OL 和OF 組促炎性細(xì)胞因子TNF-α mRNA 相對表達(dá)量極顯著低于OH 組（P＜0.01），OL 組IL-10mRNA 相對表達(dá)量極顯著高于OF 組（P＜0.01），OL 組IL-6mRNA 相對表達(dá)量顯著低于OF 組（P＜0.05），OL 組MUC2 mRNA 相對表達(dá)量極顯著高于OH 和OF 組（P＜0.01）。不同品種和益生木質(zhì)纖維素交互作用對TNF-α 和MUC2mRNA 相對表達(dá)量有顯著影響，伊莎褐雞TNF-α mRNA 相對表達(dá)量OH 組極顯著高于其他各組（P＜0.01），且邊雞TNF-α mRNA 相對表達(dá)量最小，伊莎褐雞MUC2mRNA 相對表達(dá)量OL 組極顯著高于其他各組（P＜0.01）。

表6 益生木質(zhì)纖維素和不同品種對盲腸IL-1、TNF-α、IL-10、IL-6、MUC2 mRNA 相對表達(dá)量的影響

3 結(jié)論與討論

脾臟、胸腺、法氏囊是家禽重要的免疫器官，參與體液免疫和細(xì)胞免疫，在禽類健康中占有重要的作用，其發(fā)育狀態(tài)及機(jī)能強(qiáng)弱決定著機(jī)體的免疫水平，所以，脾臟、胸腺、法氏囊質(zhì)量可以作為評價禽類免疫機(jī)能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[9]。法氏囊是禽類特有的中樞免疫器官，可產(chǎn)生B 淋巴細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生特異性抗體，完成特異性免疫應(yīng)答，因此，法氏囊指數(shù)可作為反映雞免疫機(jī)能的重要指標(biāo)之一[10]。有研究表明，在雛雞飼糧中添加一定比例的低聚木糖能夠提高雛雞免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)雛雞的免疫機(jī)能[11-12]。HUANG 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加不同劑量的殼聚糖能夠促進(jìn)肉雞免疫器官的發(fā)育。本研究表明，20 周邊雞胸腺免疫器官指數(shù)高于伊莎褐雞，說明邊雞的免疫機(jī)能相對好于伊莎褐雞。20 周高纖維組對脾臟、胸腺和法氏囊免疫器官指數(shù)有增加的趨勢，說明添加益生木質(zhì)纖維素增強(qiáng)了雞體免疫機(jī)能，與前人[11-13]的研究一致。

腸道黏膜屏障在畜禽生長發(fā)育中占有重要作用。腸黏膜組織結(jié)構(gòu)的完整性是衡量腸免疫功能的重要指標(biāo)[14]。腸絨毛受損時，短而寬，出現(xiàn)不完整和斷裂、脫落的結(jié)構(gòu)[15]。腸隱窩是腸道上皮細(xì)胞分化發(fā)育的關(guān)鍵場所，合理的隱窩深度是腸黏膜健康的標(biāo)志。當(dāng)腸道炎性疾病發(fā)生時，腸隱窩深度會加深，因此，絨隱比（V/C）能夠反映腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的整體狀況[16]。謝燕娟等[17]研究了稻殼粉、苜蓿草粉、羊草粉對成年鵝腸道組織形態(tài)變化的影響，發(fā)現(xiàn)稻殼粉顯著提高了成年鵝十二指腸絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度，顯著提高空腸絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度的比值；不同纖維源對十二指腸和空腸長度影響差異不顯著，稻殼粉組回腸長度顯著高于苜蓿草粉組與羊草粉組。章學(xué)東等[18]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加適量的苜蓿草粉，能夠增加蛋雞的大小腸、盲腸長度和絨毛高度，增加盲腸內(nèi)大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量。劉記強(qiáng)[19]以苜蓿草為纖維源飼喂固始雞，結(jié)果表明，雞腸道絨毛高度增加或呈增加趨勢，隱窩深度變淺。本研究表明，9～20 周OL組對盲腸V/C 沒有顯著影響，20 周邊雞OF、OL 和OH 組V 均相應(yīng)高于伊莎褐雞，但差異不顯著，表明20 周邊雞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力高于伊莎褐雞，說明邊雞腸道組織形態(tài)功能較伊莎褐雞好，這與前面20 周邊雞的免疫性能比伊莎褐雞好結(jié)果一致。

黏液層是一個動態(tài)屏障，通過杯狀細(xì)胞不斷分泌黏液[20]。黏液是腸粘膜免疫系統(tǒng)的一部分，對于防御病原物的入侵有著重要意義。MAHESH 等[21]研究表明，與無菌（GF）對照組相比，給小鼠添加富含膳食纖維的日糧可增強(qiáng)小鼠結(jié)腸黏液層厚度。本試驗結(jié)果表明，20 周伊莎褐雞的盲腸黏液層厚度顯著高于邊雞，說明伊莎褐雞的腸道機(jī)械屏障功能高于邊雞，能夠更好地抵制有害物質(zhì)的入侵。但是，對于邊雞而言，添加益生木質(zhì)纖維素盲腸黏液層厚度均高于對照組，是否與邊雞因缺乏纖維使腸道菌群因為饑餓而“吃”黏液，導(dǎo)致了20 周伊莎褐雞C 值也極顯著低于邊雞，也間接的說明了邊雞耐粗纖維的能力較伊莎褐雞強(qiáng)，有待進(jìn)一步研究。另外，邊雞和伊莎褐雞OL 組黏液層厚度分別高于對照組和高纖維組，表明低纖維組可更好的防御病原微生物的入侵，保持腸道健康，這與之前OL 組可改善盲腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究一致。

黏液層是腸黏膜的首要屏障，黏液的主要成分黏蛋白由腸上皮中杯狀細(xì)胞分泌。因此，黏蛋白MUC2 表達(dá)量可作為評價腸道健康狀態(tài)的重要指標(biāo)之一[22]。黏蛋白是黏液層的主要成分，黏液層越厚，表明黏蛋白越多。張莉[23]研究表明，微晶纖維素（是一種發(fā)酵性能低且黏度低的纖維）顯著降低盲腸黏蛋白2（MUC2）和緊密連接蛋白-1（ZO-1）的mRNA 表達(dá)。本研究表明，20 周OL 組提高了盲腸MUC2mRNA 表達(dá)水平，伊莎褐雞和邊雞OL 組均有助于保持機(jī)械屏障，這與前面黏液層厚度的研究一致，推測OL 組可通過增加黏液層厚度來增加杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白MUC2 含量。

腸道各類細(xì)胞因子是腸道免疫屏障的重要組成部分。各種促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子之間的協(xié)同作用是是調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥發(fā)展的關(guān)鍵。張莉[23]研究表明，仔豬日糧中添加菊粉和果膠可以顯著提高結(jié)腸緊密連接蛋白-1（ZO-1）的表達(dá)，顯著降低回腸IL-1β、盲腸TNF-α 的表達(dá)；菊粉可以顯著降低回腸TNF-α 的表達(dá)、有降低盲腸IL-8 和提高IL-10含量的趨勢。本試驗表明，20 周低水平益生木質(zhì)纖維素組降低了促炎性細(xì)胞因子IL-1的分泌水平，增加了抗炎性細(xì)胞因子IL-10的分泌水平。這與前面20 周低纖維組顯著增加黏液層厚度的研究一致。20 周IL-10水平增加促進(jìn)MUC2水平的分泌，這與前人研究一致，IL-10能夠抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，促進(jìn)杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白。試驗同時發(fā)現(xiàn)，伊莎褐雞和邊雞OL 組均可有效抑制促炎性細(xì)胞因子的分泌，表明低纖維組可以通過增強(qiáng)腸道體液免疫功能，增強(qiáng)盲腸腸道免疫屏障，維護(hù)腸道健康。

綜上所述，添加低水平（2%）益生木質(zhì)纖維素提高了伊莎褐雞和邊雞的免疫器官指數(shù)、改善了盲腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及盲腸黏液層厚度，并抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，提高抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減緩了腸道炎癥的發(fā)生。