加味人參四逆湯對急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能的保護機制研究

李影雄， 蔡海榮， 蔡惠鈴， 蔡鑫桂， 李志雄， 李懷國， 雷凱君

（1.佛山市中醫(yī)院，廣東佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510120）

急性心肌梗死是指冠狀動脈閉塞血流中斷引起的心臟缺血缺氧性壞死，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率等特點。心力衰竭是急性心肌梗死的嚴重并發(fā)癥，心肌梗死-心室重構-心力衰竭這一心血管事件鏈是導致急性心肌梗死患者死亡的最主要原因[1]。急性心肌梗死后心臟發(fā)生心室重構，引起心室收縮功能異常，最后發(fā)展為心力衰竭，嚴重影響患者的生存質量和預后。調查顯示，全球約40%急性心肌梗死患者出現(xiàn)心力衰竭[2]，而心肌梗死后一旦出現(xiàn)心力衰竭，5年生存率僅為35%[3]，合并重度心力衰竭的急性心肌梗死患者1年死亡率更是高達50%[4]。因此，防治心肌梗死后心力衰竭對降低急性心肌梗死患者的病死率和改善預后均具有重要的意義。心肌梗死后心力衰竭屬于中醫(yī)學“喘證”“心悸”“水腫”等范疇，中醫(yī)學認為，本病病機總屬于陽虛水泛，陽虛不能化水，水凌心肺，發(fā)為喘證，故治療當以溫陽制水為大法。加味人參四逆湯是在人參四逆湯基礎上加川芎、葶藶子、茯苓而成，具有益氣溫陽、活血利水作用。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，加味人參四逆湯用于治療急性心肌梗死后心力衰竭患者，可以降低患者血清腦利鈉肽（BNP）、肌鈣蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶含量，提高左心室射血分數，減輕水腫。為進一步探討加味人參四逆湯治療急性心肌梗死后心力衰竭的作用機制，本研究觀察加味人參四逆湯對急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能、血流動力學、神經體液因子、心肌纖維化的影響，以期為其臨床治療急性心肌梗死后心力衰竭提供依據，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物SPF級健康雄性SD大鼠55只，6～7周齡，體質量（180±20）g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（粵）2019-0035。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，濕度50%～65%，光照/黑暗12 h交替。實驗單位：廣東省中醫(yī)院實驗動物中心[使用許可證號：SYXK（粵）2018-0094]。

1.2藥物加味人參四逆湯（紅參10 g，熟附子15 g，干姜10 g，甘草6 g，葶藶子10 g，川芎10 g，茯苓10 g）中藥由國藥集團馮了性（佛山）藥材飲片有限公司提供，由佛山市中醫(yī)院制劑中心制備，每次加入5倍量的水煎煮2次，每次煎煮50 min，合并煎液，過濾，濃縮至1 g/mL，于-4℃冰箱保存下備用。培哚普利叔丁胺片，施維雅（天津）制藥有限公司，國藥準字H20034053，批號：20190312。

1.3試劑與儀器大鼠BNP酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E07972r-1）；大鼠cTnT ELISA試劑盒（上海莼試生物科技有限公司，貨號：CSELISA5303）；大鼠血管緊張素I（Ang I）ELISA試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司，貨號：H-ELANG I），大鼠醛固酮（ALD）ELISA試劑盒（上海古朵生物科技有限公司，貨號：GD-AW2091）；大鼠心房鈉尿肽（ANP）ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：ER0738）；丙二醛（MDA）ELISA試劑盒（上海研生實業(yè)有限公司，貨號：YS-E8429）；超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：ER0332）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海研生實業(yè)有限公司，貨號：YS-E8689）；白細胞介素1（IL-1）ELISA試劑盒（上海研生實業(yè)有限公司，貨號：YS-E8809）。KH20R-Ⅱ多功能冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；SpectraMax iD5酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；SpectraMax QuickDrop超微量全波長分光光度計[美谷分子儀器（上海）有限公司]；MP2001電子天平（南京菲奇工貿有限公司）；倒置熒光顯微鏡[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿易公司]。

1.4動物分組與模型構建將55只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術組、模型組、培哚普利組和中藥組，每組15只。將模型組、培哚普利組和中藥組大鼠采用手術結扎冠狀動脈左前降支（LAD）方法建立急性心肌梗死后心力衰竭模型。方法：將大鼠腹腔注射40 mg/kg苯巴比妥麻醉后，氣管插管輔助通氣，仰臥位固定，頸、胸部備皮消毒，打開胸廓后撕開心包膜暴露心臟，尋找冠狀動脈左前降支并在中上1/3處結扎，觀察心臟由粉紅色變?yōu)榘瞪n白色后回納至胸腔，縫合胸壁，術后注射青霉素200萬U·kg-1·d-1預防感染。假手術組大鼠僅開胸后穿刺，不結扎冠狀動脈左前降支。術后14 d應用心臟彩超檢測左心室射血分數（LVEF），若LVEF下降20%～30%即可判斷急性心肌梗死后心力衰竭大鼠模型建立成功。結果顯示：實驗過程中假手術組大鼠死亡1只，模型組和中藥組各死亡6只，培哚普利組死亡7只，模型組1只造模不成功，予以剔除，各組剩余大鼠造模均成功。

1.5給藥方法按照徐叔云等[5]主編的《藥理實驗方法學》中人和動物體表面積折算的等效劑量比率關系換算，中藥組大鼠組給予加味人參四逆湯7.5 g·kg-1·d-1進行灌胃，每天2次；培哚普利組大鼠給予培哚普利叔丁胺片混懸液0.42 mg·kg-1·d-1灌胃，每天2次；假手術組和模型組大鼠給予等體積的生理鹽水灌胃，每天2次。連續(xù)給藥14 d。

1.6血流動力學指標采集最后1次灌胃后禁食不禁飲12 h后，給予大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉后，頸部常規(guī)消毒后，分離皮膚、肌肉組織后尋找頸總動脈，用手術剪剪開頸總動脈，插入左心室導管，將導管的另一端連接八導生理記錄儀，記錄大鼠心臟頻率（HR）、左心室內壓最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室內壓最大下降速率（-dp/dtmax）、左心室內壓（LVSP）、左心室舒張末期壓（LVEDP）。應用心臟彩超檢測LVEF。

1.7實驗室指標檢測采集血流動力學指標后，開腹，經腹主動脈取血10 mL，以3 000 r/min離心15 min，取血清，-80℃保存，檢測血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP的含量。稱取心臟組織500 mg，加生理鹽水4℃研磨制成10%勻漿，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用ELISA法檢測心肌組織MDA、SOD、TNF-α、IL-1水平。

1.8病理學檢測將大鼠麻醉后開胸暴露心臟，取心臟梗死組織，以多聚甲醛固定24 h，脫水包埋，制成5μm切片。蘇木素-伊紅（HE）染色后，顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)和纖維化程度。

1.9統(tǒng)計方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）方法，兩兩間比較采用LSD-t方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠血流動力學指標的比較表1結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠HR、+dp/dtmax、LVSP、LVEF水平明顯降低（P＜0.05），-dp/dtmax、LVEDP水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和培哚普利組大鼠HR、+dp/dtmax、LVSP、LVEF水平明顯升高（P＜0.05），-dp/dtmax、LVEDP水平明顯降低（P＜0.05），且2個治療組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠血流動力學指標的比較Table 1 Comparison of the hemodynamic indexes between various groups of rats （x±s）

2.2各組大鼠血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP水平的比較表2結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和培哚普利組大鼠血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP水平均明顯降低（P＜0.05），且2個治療組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP水平的比較Table 2 Comparison of the serum BNP，cTnT，Ang I，ALD，ANP levels between various groups of rats （x±s）

2.3各組大鼠心肌MDA、SOD、TNF-α、IL-1水平的比較表3結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠心肌SOD水平明顯降低（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-1水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和培哚普利組大鼠心肌SOD水平明顯升高（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-1水平明顯降低（P＜0.05），且2個治療組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠心肌MDA、SOD、TNF-α、IL-1水平的比較Table 3 Comparison of the levels of MDA，SOD，TNF-α，IL-1 in cardiac muscle tissue between various groups of rats （x±s）

2.4各組大鼠心肌結構變化圖1結果顯示：假手術組大鼠心肌組織染色均勻，心肌纖維形態(tài)結構正常，分界清晰，排列規(guī)則，間質未見明顯異常，未見明顯炎癥；模型組大鼠心肌組織局部大量心肌細胞消失，被增生的纖維結締組織取代，可見較多新生毛細血管，并伴有炎性細胞和巨噬細胞浸潤；中藥組和培哚普利組大鼠正常心肌細胞較模型組大鼠增多，纖維結締組織較模型組減少，炎性細胞和巨噬細胞浸潤較模型組大鼠減輕。

圖1 各組大鼠心肌結構變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the changes of myocardial structure between various groups of rats（by HE staining，×200）

3 討論

中醫(yī)學認為，急性心肌梗死后心力衰竭為本虛標實之病，以陽氣虛為本，瘀、水為標。腎為水臟，心主血脈，急性心肌梗死后陽氣虧虛，腎虛則不能蒸化水液，心虛則血脈無主，水濕凝聚，氣為血之帥，氣虛則血行不暢而為瘀血，陽虛則血寒凝固而為瘀血，血不利則為水，兩水相合，上凌心肺，發(fā)為心悸、氣短、咳喘、口唇紫紺、腹脹、水腫之癥[6-7]。因此，治療急性心肌梗死后心力衰竭應以溫陽益氣、活血利水為法。人參四逆湯（《傷寒論》），由人參、附子、干姜、甘草組成，方中：人參為補氣要藥，大補元氣，固脫生津；附子為驅寒回陽要藥，辛甘大熱，走而不守，回陽救逆，補火助陽，兼暖脾土，化氣制水；干姜溫中補陽，助附子溫陽化氣以行水，又暖脾土以制水；甘草益氣溫中，又緩和附子、干姜之燥烈。本方在人參四逆湯基礎上，加川芎以活血化瘀，加葶藶子宣肺平喘、利水消腫，加茯苓健脾益氣、利水滲濕。諸藥合用，共奏溫陽益氣、活血利水之功?，F(xiàn)代藥理學研究結果顯示，附子中去甲烏藥堿具有增強心肌收縮力、加快心率、抗休克、保護心肌等作用[8]，人參皂苷具有增強心肌收縮力、提高心輸出量、保護心肌、抗休克等作用[9]。在前期臨床研究獲得肯定療效的基礎上，從動物實驗角度進一步探討該方的作用機制具有重要意義。

急性心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生可能與心肌纖維化導致的心室重構、心肌細胞炎性浸潤、氧化應激反應、神經體液因子等密切相關，是多種因素綜合作用的結果。心室重構是急性心肌梗死后大鼠最主要的病理變化，也是導致心力衰竭的重要原因[10]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死后出現(xiàn)明顯的心肌炎性浸潤和心肌纖維化，經過加味人參四逆湯干預后心肌炎性浸潤和心肌纖維化明顯減輕。提示加味人參四逆湯可以改善急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌炎性浸潤和減輕心肌纖維化。

BNP是一種心臟神經激素，主要由心室分泌，當急性心肌梗死患者發(fā)生心力衰竭時，心室壁張力增加導致BNP合成增加并釋放至血清中。BNP可反映左功能變化，并且是評價心力衰竭嚴重程度和預測病死率的重要指標[11]。cTnT是急性心肌梗死時心肌損傷的特異性和敏感性指標，正常血清中cTnT含量極低，當心肌損傷時血清中cTnT水平顯著升高。因此，測定血清BNP、cTnT含量可評價心力衰竭的發(fā)生和嚴重程度。心力衰竭發(fā)生時心臟功能明顯減弱，而心臟功能亦可以通過血流動力學指標進行評價。另外，LVSP是等容收縮期左心室內壓力峰值，當心肌收縮力增強時LVSP可升高，是評價左室收縮功能的重要指標[12]；LVEDP為左心室舒張末期內壓，反映左心室舒張功能和順應性，而心力衰竭患者由于收縮能力減弱而引起左心室舒張末期容量增加，進而引起LVEDP也升高；+dp/dtmax反映心肌收縮成分的縮短最大速度，可評價左心室收縮功能；而-dp/dtmin反映了心肌舒張時心肌纖維舒張最大速度，可評價左室舒張功能；+dp/dtmax與-dp/dtmin一起可綜合反映左心室的收縮和舒張功能；LVEF可評價左心室射血能力，心力衰竭患者由于左心室收縮功能降低而引起射血能力減弱。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠HR、+dp/dtmax、LVSP、LVEF水平明顯降低（P<0.05），-dp/dtmax、LVEDP和血清BNP、cTnT水平明顯升高（P<0.05）；而經過加味人參四逆湯干預后，HR、+dp/dtmax、LVSP、LVEF水平明顯升高（P<0.05），-dp/dtmax、LVEDP和血清BNP、cTnT水平明顯降低（P<0.05）。提示加味人參四逆湯可以改善急性心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能，提高射血分數。

心力衰竭的發(fā)生與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活密切相關。腎素活性升高，使AngⅠ水平明顯提高，并且在血管緊張素轉化酶作用下轉化為AngⅡ，后者進一步刺激腎上腺皮質分泌ALD，引起水鈉潴留，增加心室容量負荷和房室壓力[13]。心力衰竭時心室分泌ANP，在一定程度上可減輕心臟負荷，緩解心力衰竭引起的血容量增加，改善心功能，但是其作用微弱[14]。隨著心力衰竭發(fā)展和惡化，血清中ANP含量明顯增加，因而ANP是評價心力衰竭的重要指標。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠血清AngⅠ、ALD、ANP水平明顯升高（P<0.05），而經過加味人參四逆湯干預后大鼠血清AngⅠ、ALD、ANP水平明顯降低（P<0.05）。提示加味人參四逆湯可以抑制急性心肌梗死后心力衰竭大鼠神經體液因子的分泌。

心力衰竭的發(fā)生發(fā)展還與氧化應激和炎性反應密切相關。急性心肌梗死后心肌組織自由基生成增加，破壞心肌細胞膜，發(fā)生脂質過氧化[15]。正常情況下，體內存在清除自由基和抑制自由基反應的酶系統(tǒng)，如SOD可以清除氧自由基，維持動態(tài)平衡。MDA是脂質過氧化產物，可以反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。急性心肌梗死時心肌產生大量炎性因子，TNF-α和IL-1分泌明顯上升，不僅可以誘導心肌細胞凋亡和心室重塑，惡化心力衰竭的發(fā)展，而且可以引起炎癥瀑布級聯(lián)反應[16-17]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌SOD水平明顯降低，MDA、TNF-α、IL-1水平明顯升高（均P<0.05），而經過加味人參四逆湯干預后，SOD水平明顯升高，MDA、TNF-α、IL-1水平明顯降低（均P<0.05）。提示加味人參四逆湯可減輕急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌氧化應激和炎性反應。

綜上所述，加味人參四逆湯可以改善急性心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能，改善血流動力學，抑制神經體液因子分泌，減輕心肌氧化應激、炎性浸潤和纖維化。