宏基因組測序技術在不同年齡段兒童重癥肺炎病原檢測中的應用

姚仲偉 李美錦 林虹 蘇淑芬 吳松 韓爭爭 鄭亦男廣東省婦幼保健院PICU，廣州511400

肺炎是嬰幼兒時期發(fā)病率和病死率均較高的疾病，以證據(jù)為基礎的干預措施和管理策略對嬰幼兒時期高死亡率的國家來說是很有必要的。而成功管理嬰幼兒肺炎取決于早期的診斷和及時有效的治療。傳統(tǒng)臨床病原體檢測手段有限，臨床醫(yī)生主要依靠嬰幼兒時期發(fā)病時間和存在的高危因素給予相應的經(jīng)驗性治療，如果能找到一種檢測技術，能夠同時進行上千種甚至更多種病原體的檢測，無疑對臨床治療是有益的。

有超過90%的兒童呼吸道感染由病毒引起。文獻報道，嬰兒出生后第1年約50%感染過呼吸道合胞病毒（RSV）［1-3］，隨著年齡增長感染率有下降趨勢［4-7］。腺病毒在我國的感染率也相對較高，嬰幼兒時期被感染的概率較大，其中腺病毒7型甚至可導致重癥肺炎。又有文獻指出，流感病毒感染中3～7歲以流感A為主，但流感B近年來有上升趨勢［8-9］。本研究采用宏基因組測序技術（metagenomic next generation sequencing，mNGS）對本院PICU收治的77例重癥肺炎患兒的肺泡灌洗液進行檢測分析，探討嬰幼兒重癥肺炎病原菌在不同年齡段的分布情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2019年4月至2020年1月入住本院PICU的診斷為重癥肺炎并行纖維支氣管鏡檢查的患兒。研究對象入選標準：⑴1個月＜年齡＜14歲；⑵診斷為重癥肺炎并行纖維支氣管鏡檢查；⑶排除心血管和氣管支氣管畸形，及先天性支氣管肺發(fā)育不良。

1.2 診斷標準重癥肺炎的診斷標準參照中華醫(yī)學會兒科分會呼吸學組，結(jié)合我國實際情況制定的診斷標準［10-12］，具體如下。⑴嬰幼兒：腋溫≥38.5℃，呼吸頻率（RR）≥70次/min（除外發(fā)熱哭吵等因素影響），胸壁吸氣性凹陷，鼻扇，紫紺，間歇性呼吸暫停、呼吸呻吟，拒食；⑵年長兒：腋溫≥38.5℃，RR≥50次/min（除外發(fā)熱哭吵等因素影響），鼻扇，紫紺，呼吸呻吟，有脫水征。

1.3 標本收集收集的標本為肺泡灌洗液，肺泡灌洗液的取樣操作為：支氣管肺泡灌洗術均要求在局部麻醉下完成，一般選擇在病變肺段，若為彌漫性感染，則應選擇肺葉中葉或舌葉，對于嬰兒則多選擇右肺下葉。在行纖維支氣管鏡操作時，將支氣管鏡嵌于肺葉的目的片段，利用溫無菌生理鹽水進行灌洗，總灌洗液量1～3 ml/kg，分3次，同時利用吸引器以25～100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的負壓將液體回收至無菌的塑料收集器，立即送檢，或保存在-80℃的冰箱里，并且及時送檢。收集符合入選標準患兒相應的臨床信息及病原學檢查結(jié)果。

1.4 mNGS由廣州微遠基因生物公司完成，包括DNA和RNA兩部分的監(jiān)測。RNA部分進行了宿主細胞核糖體RNA的去除步驟以提高RNA病毒的檢測靈敏度。mNGS技術通過臨床樣本總核酸提取后，隨機引物建庫，PCR擴增出該樣本中的所有微生物，最后通過對擴增片段的序列測定和比對鑒定具體的微生物種類，然后再扣除正常人群中出現(xiàn)的微生物群落背景，來找到所檢測臨床標本中可能致病的微生物。

2 結(jié) 果

本研究共回顧分析77例重癥肺炎肺泡灌洗液標本，其中小于6個月齡36例，6個月～2歲22例，2～5歲13例，大于5歲6例。

小于6個月年齡段36例患兒中有4例檢測結(jié)果陰性，其余32例檢測陽性，陽性率為88.8%，所有標本DNA和RNA共檢出39種病原菌，其中混合感染7例，7例混合感染中RSV合并其他病原菌感染的占5例，具體見表1。6個月～2歲年齡段22例患兒均陽性，陽性率為100.0%，所有標本DNA和RNA共檢出15種病原菌，其中混合感染3例，副流感病毒合并感染2例，RSV合并感染1例，具體見表2。2～5歲年齡段13例患兒均陽性，陽性率為100.0%，所有標本DNA和RNA共檢出7種病原菌，無混合感染，其中腺病毒7型占比明顯高于其他病原菌，具體見表3。大于5歲年齡段6例患兒均陽性，陽性率為100.0%，所有標本DNA和RNA共檢出6種病原菌，1例混合感染為RSV合并巨細胞病毒感染，具體見表4。

表1 小于6個月組36例重癥肺炎肺患兒檢出病原菌及構(gòu)成比

表2 6個月～2歲組22例重癥肺炎肺患兒檢出病原菌及構(gòu)成比

表3 2～5歲組13例重癥肺炎肺患兒檢出病原菌及構(gòu)成比

表4 大于5歲組6例重癥肺炎肺患兒檢出病原菌及構(gòu)成比

3 討 論

小兒肺炎是嬰幼兒時期常見的感染性疾病，發(fā)病率高，居住院患兒首位。重癥肺炎病死率高達20%～30%，是發(fā)展中國家5歲以下兒童死亡的重要原因，明確病原體對治療及預后有著重要的指導意義。宏基因組測序技術在病原學檢測方面有著快速、高效、高靈敏度的特點［13-15］。本文77例患兒在小于6個月年齡段檢測陽性率88.8%，其余年齡段陽性率均為100.0%，總陽性率為94.8%，臨床依托高效的病原學檢測結(jié)果精準治療，77例患兒除1例有先天性聯(lián)合免疫缺陷病家屬放棄治療簽字出院以外，其余76例均治愈出院。

6個月以內(nèi)的嬰幼兒肺炎，特別是重癥肺炎或反復出現(xiàn)的肺炎，在排除心血管和氣管畸形之后需考慮到宮內(nèi)感染、產(chǎn)時感染和生后感染，其中生后感染最為常見。多個文獻報道，生后1年內(nèi)RSV感染比例較高，超過50.0%。阿根廷圣胡安省的兒童RSV感染以7個月以內(nèi)的嬰幼兒感染最為多見，常年發(fā)病，無明顯季節(jié)性。本研究顯示小于6個月年齡段中RSV檢出率占15.3%，另外腺病毒7型10.2%，其次為巨細胞病毒、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、細小脲原體，各占7.6%，沙眼衣原體、肺炎支原體、白色念珠菌各占5.1%，其余病原菌占比較低。數(shù)據(jù)顯示，RSV仍然為嬰幼兒最常見感染病原，且容易合并感染，本組患兒中混合感染病例中RSV占71.4%。另外在小于6個月年齡段檢出細小脲原體3例，沙眼衣原體2例，解脲支原體1例，此3種病原多為產(chǎn)時感染，回顧此6例病史均為順產(chǎn)出生，故產(chǎn)時感染的可能性極大。因此，小于6個月嬰幼兒重癥肺炎病原菌以產(chǎn)后感染和產(chǎn)時感染比例較高。

近年來腺病毒7型導致嬰幼兒及兒童重癥肺炎較為常見。本研究顯示，腺病毒7型在小于6個月、6個月～2歲、2～5歲、大于5歲年齡段分別占10.2%、30.4%、46.0%、16.0%，是所有病原菌中年齡分布最廣的，在小于6個月和大于5歲年齡段居第2位，在6個月～2歲和2～5歲年齡段均居第1位，且占比遠遠高于其他病原菌；說明腺病毒7型在嬰幼兒及兒童重癥肺炎發(fā)病中占重要因素，在各年齡階段均較多見，特別高發(fā)年齡為6個月～5歲。

文獻報道，流感病毒近年來有上升趨勢［16-20］。本研究顯示，各年齡段流感病毒感染均不多見，在6個月～2歲年齡段副流感病毒居第2位，但占比較第1位的腺病毒相差甚遠，故流感病毒雖有上升趨勢，但導致嬰幼兒及兒童重癥肺炎尚不多見。

多個國家數(shù)據(jù)顯示，在百日咳疫苗使用前約80.0%的百日咳患者為5歲以下兒童，41.0%為1歲以下嬰兒，但在百日咳疫苗使用后這一年齡構(gòu)成發(fā)生了變化［6］。在疫苗覆蓋率超過90.0%的國家，百日咳高發(fā)人群為3～9歲兒童。我國1991—1997年監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，95.0%以上的百日咳病例＜15歲，其中＜7歲和＜5歲兒童分別占80.0%和60.0%；2004—2006年監(jiān)測顯示，＜7歲兒童占85.0%以上。本研究百日咳桿菌在大于5歲和小于6個月年齡段各檢出1例，尚無法得出年齡分布特點，需要更大樣本研究或基于百日咳肺炎的專項研究。

卡氏肺孢子蟲是一種真菌，廣泛寄生于人和哺乳動物肺泡內(nèi)，在健康宿主體內(nèi)不引起癥狀，當機體免疫力下降時才會大量繁殖從而致病。原發(fā)性免疫缺陷病感染發(fā)生的年齡40.0%在1歲以內(nèi)，40.0%在1～5歲，15.0%在6～16歲，5.0%發(fā)生在成人。本研究顯示，2～5歲年齡段檢出卡氏肺孢子蟲，符合免疫缺陷發(fā)病特點。

總之，嬰幼兒及兒童重癥肺炎隨著年齡增長，患者例數(shù)逐漸下降，病原菌種類逐漸減少，構(gòu)成比例也不斷變化，通過總結(jié)發(fā)現(xiàn)不同年齡段病原菌的分布情況，再結(jié)合臨床征象以求精準、及時掌握重癥肺炎患兒病原菌，爭取早期診斷與治療，提高嬰幼兒重癥肺炎治愈率。