基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析MFAP2在食管癌中表達(dá)及其預(yù)后意義

孫文 舒揚(yáng)

1常州市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇213000；2江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，鎮(zhèn)江212000

食管癌是世界上第八大癌癥，同時(shí)病死率在癌癥相關(guān)死亡中排名第六［1］。食管癌有80%的病例發(fā)生在欠發(fā)達(dá)的發(fā)展中國(guó)家，其中亞洲和非洲發(fā)病率最高［2］。食管癌通常被診斷出來(lái)就已是晚期階段，主要原因是癌癥早期缺乏典型的臨床癥狀以及與其他相關(guān)疾病癥狀相似而被漏診?；加型砥诩膊』颊咦畛Ｒ?jiàn)的癥狀是會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難或無(wú)意識(shí)的體質(zhì)量減輕［3］。全球食管癌患者5年總體生存率為15%～20%［4］，所以提高疾病的早期診斷率有助于降低病死率。本文的研究目的就是要尋找到一個(gè)新的食管癌預(yù)后生物標(biāo)志物。

微纖維相關(guān)糖蛋白2（MFAP2）存在于許多組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，是彈性蛋白相關(guān)微纖維的主要抗原，可與原纖維蛋白相互作用以調(diào)節(jié)微纖維的功能，也是遺傳性結(jié)締組織病的病因。目前的科學(xué)研究表明，MFAP2在很多腫瘤中的表達(dá)增高，例如胃癌［5］、黑色素瘤［6］、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，但MFAP2在食管癌中表達(dá)及預(yù)后文獻(xiàn)報(bào)道少見(jiàn)。本研究首先檢索Oncomine及GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)MFAP2在食管癌中的表達(dá)信息，然后利用在線網(wǎng)站UALCAN從多個(gè)角度分析MFAP2在不同臨床信息的食管癌患者組織樣本中的mRNA表達(dá)，并通過(guò)Kaplan-Meier Plotter在線分析MFAP2在食管癌中的表達(dá)與臨床預(yù)后的相關(guān)性；最后通過(guò)STRING構(gòu)建目的基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以期了解MFAP2在食管癌中的功能作用，為尋找新的食管癌早期診斷指標(biāo)、預(yù)后標(biāo)記物及潛在的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MFAP2在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.oncomine.org/）是一個(gè)全世界知名的腫瘤基因數(shù)據(jù)庫(kù)，可以直接生成可視化圖片結(jié)果，其高效能的分析能力和大量?jī)?chǔ)存樣本保證分析結(jié)果具有較大的參考價(jià)值。首先登錄Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)，然后進(jìn)行檢索條件的設(shè)置：（1）Input：Esophageal cancer；（2）Gene：MFAP2；（3）Select the analysis type：cancer vs.normal。通過(guò)上述搜索可以獲得有關(guān)MFAP2的數(shù)據(jù)集，然后進(jìn)行具體分析。

1.2 MFAP2在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）是基于癌癥和正常基因表達(dá)譜分析的一個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)。其數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA以及GTEx項(xiàng)目的腫瘤和正常樣本的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，可以進(jìn)行非常全面地表達(dá)分析。首先打開(kāi)GEPIA在線軟件，在differential genes下的Dateset選擇ESCA，其余默認(rèn)|log2FC|Cutoff：1，q-value cutoff：0.01，選用ANOVA方法，最后點(diǎn)擊List，即可得出ESCA的差異表達(dá)基因。

1.3 MFAP2基因在人食管癌和正常組織中的表達(dá)分析UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個(gè)可以公開(kāi)訪問(wèn)的癌癥數(shù)據(jù)在線分析網(wǎng)站，可以用來(lái)驗(yàn)證新的生物標(biāo)志物，提供基因表達(dá)水平、生存分析、相關(guān)性分析。利用UALCAN在線分析軟件分析MFAP2基因在食管癌及正常癌組織中的表達(dá)。在軟件主頁(yè)輸入MFAP2基因，選擇食管癌組織，獲得MFAP2在正常組織和食管癌組織中的差異表達(dá)，本研究將從原發(fā)食管癌原發(fā)組織、不同種族、不同性別、不同年齡階段、不同分期、不同分級(jí)、不同的抽煙狀態(tài)、TP53是否突變與正常鄰近組織的表達(dá)情況等多個(gè)角度分析MFAP2的表達(dá)差異。

1.4 生 存 分 析Kaplan-Meier Plotter（http：//www.kmplot.com/）是一個(gè)新的生物預(yù)后指標(biāo)分析工具，數(shù)據(jù)來(lái)源于GEO、EGA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，為了分析特定基因在腫瘤的預(yù)后價(jià)值，根據(jù)擬議生物標(biāo)志物的各種分位數(shù)表達(dá)，將患者樣品分為兩組。通過(guò)Kaplan-Meier生存圖比較這兩個(gè)患者隊(duì)列，并計(jì)算95%置信區(qū)間和logrankP值的危險(xiǎn)比。首先登錄Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入MFAP2基因，分別選擇在食管腺癌和食管鱗癌中進(jìn)行總生存分析。

1.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)STRING（http：//string-db.org/）是一個(gè)搜尋已知和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以用于分析基因組學(xué)的數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的注釋，探索預(yù)測(cè)目的基因蛋白的相互作用。數(shù)據(jù)來(lái)源于收集和重新評(píng)估有關(guān)于目前現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，已知數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)復(fù)合物［7］，然后再Search框中輸入MFAP2基因，物種選擇“Homo sapiens”進(jìn)行搜索，在“settings”中選擇minimum required interaction score為0.04，最后在“Exports”中下載。

2 結(jié) 果

2.1 MFAP2在各種腫瘤中的表達(dá)在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到了430項(xiàng)有關(guān)MFAP2基因表達(dá)在正常組與腫瘤組的研究數(shù)據(jù)集，其中MFAP2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)集一共有107項(xiàng)，有104項(xiàng)MFAP2表達(dá)增高，3項(xiàng)表達(dá)降低。而在食管癌的研究中只有4項(xiàng)表達(dá)增高，未有表達(dá)降低的研究數(shù)據(jù)集（圖1）。

2.2 MFAP2在食管癌中的表達(dá)在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中共找到4項(xiàng)MFAP2在食管癌中表達(dá)增高的數(shù)據(jù)集。這些數(shù)據(jù)集發(fā)表的雜志分別是Clinical Cancer Research、BMC Genomics、Cancer Research和PLoS One。筆者通過(guò)對(duì)找到的4項(xiàng)有關(guān)MFAP2在食管癌中表達(dá)增高的數(shù)據(jù)集中進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，MFAP2在食管癌中顯著高表達(dá)（P＜0.05）（表1）。為了驗(yàn)證以上分析結(jié)果，筆者進(jìn)一步挖掘分析GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)，在differential genes中找到食管癌數(shù)據(jù)集中的差異基因，其中包含了MFAP2基因（log2FC=2.897，校正P=8.86E-57），發(fā)現(xiàn)MFAP2基因在食管癌中的表達(dá)上調(diào)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中MFAP2基因在腫瘤中的整體表達(dá)情況

2.3 MFAP2基因在不同臨床信息的食管癌組織及正常組織中的表達(dá)利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析MFAP2基因在不同臨床信息的食管癌組織與正常組織中的表達(dá)差異。通過(guò)上述UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，筆者發(fā)現(xiàn)和正常組織相比，MFAP2基因在21～60歲人群、1級(jí)食管癌患者、吸煙的食管癌患者中顯著上調(diào)（圖2）。

2.4 MFAP2在食管癌中的生存預(yù)后分析為了探索MFAP2與食管癌之間的生存預(yù)后關(guān)系，利用Kaplan-Meier Plotter在線網(wǎng)站，分別獲得MFAP2在食管腺癌及食管癌的臨床樣本，并進(jìn)行總生存分析。根據(jù)目的基因的表達(dá)差異將其分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MFAP2基因在高表達(dá)組的食管腺癌患者生存率較低（P=0.035），而MFAP2的表達(dá)水平與食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存預(yù)后之間不存在相關(guān)（P=0.066）（圖3）。

通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)Kaplan-Meier Plotter進(jìn)一步探索MFAP2在不同食管腺癌中的生存預(yù)后關(guān)系，對(duì)不同臨床樣本信息的食管腺癌患者進(jìn)行生存預(yù)后分析：在男性，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞富集、富含2型輔助性T細(xì)胞的食管腺癌患者中生存率較低，預(yù)后相對(duì)較差。而在巨噬細(xì)胞富集的食管癌患者中生存率較高，預(yù)后較好（圖4）。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建MFAP2基因的PPI網(wǎng)絡(luò)用于探索MFAP2基因的功能，共發(fā)現(xiàn)10個(gè)與之相關(guān)的功能蛋白（圖5）。其中纖維蛋白1（FBLN1）引起了注意，F(xiàn)BLN1是一種分泌的糖蛋白，已整合到纖維狀細(xì)胞外基質(zhì)中，需要鈣結(jié)合來(lái)介導(dǎo)其與層粘連蛋白和硝態(tài)素的結(jié)合。FBLN1通過(guò)結(jié)合纖維蛋白原介導(dǎo)血小板粘附。FBLN1在結(jié)腸癌［12］、肝癌［13］中已有相關(guān)報(bào)道。這個(gè)蛋白基因也被證實(shí)與食管腺癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有關(guān)［14］。為了進(jìn)一步確定它們之間的關(guān)系，筆者通過(guò)在線軟件GEPIA進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MFAP2與FBLN1的表達(dá)為正相關(guān)（圖6）。

3 討 論

食管癌是一個(gè)極具侵略性和較差存活率的異質(zhì)性疾病，由于其遺傳學(xué)病史及較低的早期診斷率，是全世界面臨的健康問(wèn)題之一，也是中國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［15］，在我國(guó)各種惡性腫瘤中病死率占居第4位。在中國(guó)有一個(gè)明顯的特征，就是城市與農(nóng)村的食管癌患者分布不一致，農(nóng)村地區(qū)的食管癌患者的發(fā)病率遠(yuǎn)高于城市地區(qū)的患者［16］。食管癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素有吸煙、飲酒、肥胖、胃食管反流、飲食習(xí)慣等。其中食管腺癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素是肥胖、胃食管反流，反流癥狀越頻繁、越嚴(yán)重、持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，風(fēng)險(xiǎn)就越大。吸煙和飲酒是食管鱗狀細(xì)胞癌患者的兩大危險(xiǎn)因素，常見(jiàn)于發(fā)達(dá)國(guó)家［17］。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，對(duì)食管癌分子組成的全面理解不僅需要關(guān)注腫瘤細(xì)胞，而且還需要關(guān)注腫瘤微環(huán)境，其中包含多種細(xì)胞群、信號(hào)傳導(dǎo)因子以及與腫瘤細(xì)胞相互作用并支持腫瘤各個(gè)階段的結(jié)構(gòu)分子［18］，了解食管癌的發(fā)生發(fā)展對(duì)于其診斷和治療非常重要。筆者運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)以上數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析挖掘，發(fā)現(xiàn)MFAP2在食管癌中表達(dá)上調(diào)以及MFAP2高表達(dá)的食管腺癌患者的生存率低。

近年來(lái)，有關(guān)MFAP2基因在腫瘤中過(guò)表達(dá)的報(bào)道越來(lái)越多，而未見(jiàn)其在食管癌中的研究報(bào)道。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine在線分析發(fā)現(xiàn)MFAP2基因在食管癌中的表達(dá)增高。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)在線對(duì)目的基因MFAP2進(jìn)行差異分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。為了進(jìn)一步了解MFAP2在不同臨床病理信息的食管癌患者中的表達(dá)情況，筆者利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和正常的食管組織相比，MFAP2在21～60歲的人群，分級(jí)為1級(jí)的患者中，抽煙的食管癌患者中MFAP2基因上調(diào)更顯著。利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線分析，把MFAP2基因按表達(dá)水平分為兩組，分別為表達(dá)上調(diào)組和表達(dá)下調(diào)組，在表達(dá)上調(diào)組的食管腺癌患者總體生存率較差；然而MFAP2的表達(dá)水平與食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存預(yù)后之間不存在相關(guān)。筆者通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)Kaplan-Meier Plotter又進(jìn)一步探索MFAP2在不同臨床信息及不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的食管腺癌患者中的預(yù)后分析，結(jié)果顯示：在男性、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞富集、富含2型輔助性T細(xì)胞的食管腺癌患者中生存率較低，預(yù)后相對(duì)較差。而在巨噬細(xì)胞富集的食管癌患者中生存率較高，預(yù)后較好。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)在線構(gòu)建MFAP2基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，為研究目的基因的功能提供線索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有10個(gè)預(yù)測(cè)的功能蛋白與MFAP2相互作用，其中FBLN1蛋白基因被證實(shí)與食管腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，食管腺癌中FBLN1發(fā)生了復(fù)雜的染色體重排并產(chǎn)生了新型融合轉(zhuǎn)錄本。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MFAP2與FBLN1基因進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)MFAP2與FBLN1的表達(dá)為正相關(guān)的關(guān)系，說(shuō)明MFAP2基因可能影響食管腺癌患者的預(yù)后，也有可能會(huì)引起染色體的重排。通過(guò)對(duì)MFAP2基因在食管癌中表達(dá)及預(yù)后進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)MFAP2具有重要的研究意義，MFAP2基因作為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白［19］，可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、2型輔助性T細(xì)胞等免疫細(xì)胞共同影響著食管腺癌的腫瘤微環(huán)境［18］，同時(shí)也可能成為食管腺癌的一個(gè)新的生物學(xué)指標(biāo)以及潛在的治療靶點(diǎn)。

表1 MFAP2在食管癌研究中的過(guò)度表達(dá)情況

圖2 MFAP2在不同臨床信息的食管癌組織中的差異表達(dá)（A為正常食管組織比原發(fā)食管癌，B為正常食管組織比不同年齡段的食管癌，C為正常食管組織比不同分級(jí)的食管癌，D為正常食管組織比不同抽煙狀態(tài)的食管癌）

圖3 MFAP2在食管腺癌與食管鱗狀細(xì)胞癌中的預(yù)后生存曲線（A為MFAP2在食管腺癌中的預(yù)后生存曲線，B為MFAP2在食管鱗狀細(xì)胞癌中的預(yù)后生存曲線）

圖4 MFAP2在不同食管腺癌中的生存預(yù)后關(guān)系（A為男性食管腺癌患者的MFAP2表達(dá)，B為巨噬細(xì)胞富集患者的MFAP2表達(dá)，C為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞富集患者的MFAP2表達(dá)，D為富含2型輔助性T細(xì)胞患者的MFAP2表達(dá)）

圖5 構(gòu)建MFAP2基因相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖6 MFAP2基因與FBLN1的表達(dá)呈正相關(guān)

總之，本研究通過(guò)綜合公共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行深入挖掘，提出MFAP2可能是食管癌中的潛在的促癌基因，且生存分析發(fā)現(xiàn)MFAP2與食管腺癌患者預(yù)后有關(guān)，與食管鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后不相關(guān)，同時(shí)MFAP2可能與免疫細(xì)胞共同影響著食管腺癌的腫瘤微環(huán)境。構(gòu)建MFAP2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果提示MFAP2極有可能與染色體的異常有關(guān)。生物信息學(xué)的快速發(fā)展加快了科學(xué)研究者們研究的步伐［20］，但由于其缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的佐證，不能更深入驗(yàn)證MFAP2在食管腺癌中作用機(jī)制。所以MFAP2在食管腺癌中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其具體功能還有待進(jìn)一步研究。