顱神經損傷面頸部肌萎縮纖維化中環(huán)狀RNA差異表達分析△

高軼昳 劉菲 鄭宏良 周義德 陳世彩 黃衛(wèi) 于閱盡 郝亞楠

長期失神經支配喉肌再生能力受損，致使喉肌發(fā)生不可逆的萎縮纖維化是導致晚期聲帶麻痹神經修復術后喉功能恢復不良的重要原因[1]。目前，針對這一問題仍無有效的干預方法；因此，尋找延緩和減輕失神經骨骼肌萎縮纖維化的分子靶標是一項重要基礎研究內容。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是新近研究發(fā)現(xiàn)的一類特殊的內源性環(huán)形非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，其由特殊的可變剪切產生，通過轉錄后水平的調控機制，在基因調控中發(fā)揮著重要作用，參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[2]。研究表明circRNA的作用不僅與神經損傷后反應[3]及神經再生調控[4]密切相關，還參與了肌肉的生成與分化[5,6]，并且在骨骼肌相關疾病的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[7]；已證實 circRNA在心肌纖維化、肺纖維化和肝臟纖維化等過程中均有發(fā)揮重要調控功能[8,9]，但其在失神經支配骨骼肌尤其是顱神經損傷面頸部骨骼肌萎縮纖維化中的作用和機制尚不清楚。

本研究擬通過建立小鼠顱神經損傷面頸部骨骼肌萎縮纖維化模型，采用RNA測序(sequencing，RNA-seq)技術篩選出差異表達的circRNA,并對其可能的生物學功能及信號通路進行分析。由于C57小鼠喉體較小，喉返神經極細小、喉肌量少，形態(tài)觀察及后期實驗不夠方便準確。因此本研究改用同為面頸部的失副神經支配胸鎖乳突肌模型，且根據(jù)前期研究[1]選取失神經支配后1、2、3、4周作為分組標準，旨在為尋找預防或延緩失神經支配面頸部肌萎縮纖維化的新靶點，為提高晚期喉返神經修復的療效提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 清潔級健康雄性12周齡C57BL/6雄性小鼠共50只，體重20～30 g，由海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院中心實驗室提供。隨機分為5組，包括正常對照組和失神經支配1、2、3、4周組，每組10只小鼠。

1.2建立失神經支配胸鎖乳突肌萎縮纖維化動物模型及骨骼肌樣本采集 失神經支配1、2、3、4周組小鼠腹腔注射 4%水合氯醛行全身麻醉，仰臥位，頸部正中切口，分離出右側胸鎖乳突肌并在顱底處充分暴露出副神經主干，沿其根部剪除一段長約5 mm 副神經，使胸鎖乳突肌失去神經支配；用5-0絲線結扎神經殘端，縫合皮膚。對照組小鼠僅行右側副神經探查后取胸鎖乳突肌標本。失神經支配各組10只小鼠在相應時間點(失神經支配1、2、3、4周)于全身麻醉后取右側胸鎖乳突肌，收集到的每份標本均三等分，1/3用4%多聚甲醛固定后切片用作形態(tài)學觀察，1/3勻漿后提取總RNA用作高通量測序，剩余1/3立即凍存于液氮備用。

1.3Masson染色 將固定后的肌肉標本常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制作6 μm的石蠟切片,脫蠟和水化后切片在蒸餾水中漂洗;根據(jù)Masson染色試劑盒(南京建城生物)的說明行Masson三色染色,染色顯示細胞核呈黑色，肌肉呈紅色，膠原呈藍色;于40×光鏡下用NikonEclipse600顯微鏡(日本東京)拍照，并使用IPP5.0軟件測量膠原纖維組織截面積和肌纖維直徑。每個樣本取1張切片，隨機選取5個獨立的視野，分別計算各平均值。

1.4circRNA高通量測序 使用Magen Hipure Total RNA Mini Kit(Magen,Guangzhou,China)試劑盒，分別提取失神經支配4組及對照組樣本總RNA，總RNA質檢合格后，經探針去除核糖體RNA、核糖核酸外切酶 R去除線性RNA。采用Illumina Total RNA-seq(H/M/R)Library Prep Kit(Kapa Biosystems, Inc.Woburn, MA)文庫制備試劑構建RNA-Seq文庫，文庫質量要求為最終文庫有效濃度大于3 nM。文庫構建合格后采用第二代高通量測序技術，以獲得5組樣本中所有的circRNA表達譜，測序平臺為HiSeq X10 PE150。

1.5circRNA相關生物信息學分析 對原始數(shù)據(jù)進行過濾，獲得有效數(shù)據(jù)后與參考基因組進行比對，比對結果用于下一步circRNA 的鑒定，采用DCC軟件綜合鑒定circRNA，得到高可信circRNA，篩選差異表達circRNA(P<0.05及|Fold chang|≥1.5)。使用R軟件(clusterProfiler)對差異circRNA的親本基因進行基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。GO功能分析由生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)三部分組成,以失神經支配各組對比對照組的差異表達circRNA的親本基因為集合，進行GO功能分析，計算每個GO條目中差異基因富集的顯著性，以判定差異基因主要影響或涉及的生物學功能。生物通路富集分析主要依賴于KEGG數(shù)據(jù)庫，以探討差異表達的circRNA親本基因參與各個信號通路的情況。顯著富集標準：用超幾何檢驗的方法計算GO條目(GO term)、KEEG條目(KEGG term)P值(P<0.05)，overlapGeneCount(差異表達基因集合與 GO term 或KEGG term的交集基因數(shù)目)。

1.6統(tǒng)計學方法 通過TMM(trimmed mean of M-values)算法過濾表達過低的 circRNA(CPM>1)，利用EdgeR軟件工具進行差異表達circRNA的鑒定，通過檢驗的P值和倍數(shù)變化值篩選各個時間點相對于基線時的差異circRNA，差異表達分析標準為P<0.05及|Fold chang|≥1.5。(EdgeR軟件提供)形態(tài)學研究統(tǒng)計方法采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0進行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。

2 結果

2.1失神經支配胸鎖乳突肌形態(tài)學觀察結果 肉眼觀察對照組及各失神經支配組胸鎖乳突肌大體樣本形態(tài)，隨著失神經支配時間的延長，肌肉萎縮逐漸明顯，Masson三色染色結果顯示：隨著失神經支配時間的延長，肌纖維平均直徑及肌肉截面積逐漸縮小，膠原纖維截面積逐漸積聚增多(圖1)。在神經損傷早期，肌肉萎縮纖維化尚不明顯，失神經支配1周、2周組膠原纖維截面積、肌肉截面積及肌肉纖維直徑與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而失神經支配3周、4周組與對照組相比，以上指標差異明顯(P<0.05)(表1)；證明神經損傷后期骨骼肌組織萎縮纖維化顯著，小鼠失神經支配胸鎖乳突肌模型造模成功。

圖1 失神經小鼠胸鎖乳突肌Masson 染色形態(tài)學觀察(40×) a.對照組；b.失神經支配1周組；c.失神經支配2周組；d.失神經支配3周組；e.失神經支配4周組

表1 對照組及失神經支配小鼠胸鎖乳突肌Masson 染色定量分析比較

2.2失神經支配胸鎖乳突肌中circRNA表達譜的差異分析 本研究在5組樣本中共測序發(fā)現(xiàn)了3 090種不同的circRNA。具有差異性表達的circRNA共有1 386個，其中上調686個，下調700個。與對照組相比，失神經支配4組分別存在circRNA的差異表達(P<0.05及|Fold chang|≥1.5)(圖2)。在神經損傷的早期，circRNA的表達譜即發(fā)生了顯著變化，同時存在表達上調及下調的circRNA；并且隨著失神經支配時間的延長，circRNA的表達譜持續(xù)發(fā)生變化，與對照組相比，上調的差異表達circRNA在失神經損傷1周有83個，失神經損傷2周有138個，失神經損傷3周組有314個，失神經損傷4周有151個；下調的差異表達circRNA在失神經損傷1周有103個，失神經損傷2周有149個，失神經損傷3周有204個，失神經損傷4周有244個。

圖2 差異表達circRNA的火山圖 a.失神經支配1周組 vs 對照組；b.失神經支配2周組vs 對照組；c.失神經支配3周組 vs 對照組；d.失神經支配4周組vs 對照組，橫坐標為對應circRNA的倍數(shù)變化，縱坐標為對應circRNA差異表達的統(tǒng)計學意義。紅點和綠點表示差異表達具有統(tǒng)計學意義的circRNA(P<0.05)，其中紅色表示顯著上調的，綠色表示顯著下調的；灰點表示差異表達不顯著的circRNA(P>0.05)

2.3差異表達circRNA 親本基因的功能富集分析結果 親本基因GO分析結果顯示：在生物學過程中，失神經損傷早期主要涉及肌損傷、肌原纖維組裝、肌動蛋白絲過程的調節(jié)、肌細胞分化和發(fā)育等；而失神經損傷后期主要涉及肌細胞肥大、肌細胞程序性凋亡、骨骼肌收縮、細胞核固定、結締組織增生等。在細胞成分方面，失神經損傷后差異circRNA親本基因主要存在于肌原纖維、肌絲、收縮纖維、肌節(jié)內的肋狀帶(costamere)等，而costamere主要富集在失神經損傷4周組。在分子功能方面，失神經損傷后差異circRNA親本基因主要參與了肌肉結構組成、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、與纖維化過程中重要的調節(jié)因子SMAD結合等，其中與SMAD結合這一分子功能富集在失神經損傷3周、4周組(圖3)。

圖3 差異表達circRNA 親本基因的GO富集分析 a.失神經支配1周組 vs 對照組；b.失神經支配2周組vs 對照組；c.失神經支配3周組 vs 對照組；d.失神經支配4周組vs 對照組；橫坐標表示差異表達circRNA親本基因富集到的功能類別，縱坐標表示富集顯著性，數(shù)字代表富集到該條目的差異表達circRNA親本基因數(shù)目

KEGG通路富集分析結果表明，在失神經損傷后各時間點可同時受到多種機制的調控，在不同損傷時間點涉及的信號通路互有差別。分別總結了各實驗組富集程度較高的前10條通路(失神經支配1周組總共預測到7條通路)，結果顯示失神經損傷早期主要在Apelin信號通路、鈣信號通路、細胞周期、cGMP-PKG信號通路、局灶性粘連、泛素介導的蛋白水解等富集最顯著；而失神經損傷晚期主要涉及泛素介導的蛋白水解、TGF-β信號通路、cGMP-PKG信號通路、緊密連接、FoxO信號通路、Apelin等信號通路，其中TGF-β信號通路、Apelin信號通路、FoxO信號通路與纖維化調控密切相關(圖4)。

圖4 差異表達circRNA 親本基因的KEGG分析 a.失神經支配1周組 vs 對照組；b.失神經支配2周組vs 對照組；c.失神經支配3周組 vs 對照組；d.失神經支配4周組vs 對照組；縱坐標表示差異表達circRNA親本基因富集到的信號通路名稱，橫坐標(count)表示富集到的差異表達circRNA親本基因數(shù)目，顏色代表富集顯著性(logP)

3 討論

骨骼肌長期失神經支配后由于細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分大量聚集和肌細胞的萎縮纖維化，從而導致不可逆的病理改變，影響骨骼肌的神經再支配。這是導致晚期神經修復肌功能恢復不佳的的主要原因[10]。

circRNA廣泛存在于真核細胞中，是一類具有一個閉合圓環(huán)形結構的非編碼RNA。circRNA結構穩(wěn)定，能夠抵抗核糖核酸酶或核酸外切酶的降解，并且在組織發(fā)育階段、不同疾病中具有特異性的表達[11]，越來越多研究顯示circRNA在基因網絡調控中是至關重要的調節(jié)因子，在人類多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。circRNA相較于miRNA(microRNA 微小RNA)或小干擾RNA，具有更穩(wěn)定的結構和更低的脫靶作用，使得circRNA具有成為生物標志物和治療靶標的潛力[2]。circRNA在周圍神經損傷后修復的病理生理過程中參與調控軸突再生、神經修復[12]；而circZfp609、circLMO7、circFUT10等在維持正常肌功能、調節(jié)肌發(fā)生、增殖、分化中發(fā)揮關鍵作用[13，14]。另有最新研究顯示，多個circRNA參與多種組織器官，如：肝、肺、心的纖維化病變，其中hsa_ circ_0071410與輻射誘導的肝纖維化(RILF)相關，抑制hsa_ circ_0071410的表達可上調miR-9-5p并減弱輻射誘導的肝星狀細胞(HSC)活化[15]；circRNA-000203 和circRNA-010567可通過海綿狀結合相應的miRNA，促進心肌成纖維細胞纖維化轉型的發(fā)生[16]；circZC3H4及其下游產物ZC3H4與巨噬細胞中的二氧化硅(SiO2)刺激呈正相關，可通過circZC3H4 RNA/ZC3H4途徑激活肺成纖維細胞增殖和遷移[17]。Jeng 等(2009年)發(fā)現(xiàn)miRNA在失神經骨骼肌萎縮纖維化中起著重要作用。而circRNA存在多個miRNA互補結合位點，其對miRNA的“海綿樣作用”暗示著circRNA可能參與調控失神經骨骼肌萎縮纖維化進程。本研究建立小鼠副神經損傷模型，應用RNA-seq技術檢測失神經支配后1、2、3、4周胸鎖乳突肌萎縮纖維化過程中circRNA的差異性表達，結果表明失神經支配各組胸鎖乳突肌較對照組均存在大量差異表達的circRNA；提示差異表達circRNA可能在失神經損傷骨骼肌中發(fā)揮重要作用。進一步的生物信息學分析顯示，這些差異候選circRNA 的親本基因(來源基因)在失神經損傷的早期可能與肌損傷、肌細胞分化和發(fā)育等生物學功能相關；而后期主要與肌細胞的凋亡、結締組織增生相關。差異表達circRNA親本基因主要存在于肌原纖維、收縮纖維、肋狀帶等細胞組分。肋狀帶重點富集在失神經損傷后期，研究表明肋狀帶與肌萎縮過程密切相關[18]。這些差異表達circRNA親本基因主要參與蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、SMAD結合等分子功能；SMAD蛋白可作為TGF-β1的底物，是促進TGF-β1介導組織纖維化的主要下游調節(jié)因子(Puisters,2009)。以上功能在失神經損傷的早期可能通過cGMP-PKG信號通路、血管平滑肌收縮等通路調控；其次通過泛素介導的蛋白水解、Apelin信號通路、神經營養(yǎng)蛋白信號等通路來調控。失神經損傷的后期則涉及TGF-β信號通路、Apelin信號通路、FoxO信號通路的介導。TGF-β信號通路除了涉及腫瘤、神經系統(tǒng)等疾病外，其異常激活更是組織細胞纖維化轉型的重要病理機制[19]。研究表明神經損傷后可激活骨骼肌 TGF-β1/Smads 信號通路，在轉錄水平調控下游纖維化因子結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)等的表達，從而促進失神經支配骨骼肌萎縮纖維化[1]。近期發(fā)現(xiàn)Apelin信號通路激活后可增加成纖維細胞的增殖遷移，最終導致骨骼肌萎縮纖維化[20]。FoxO信號通路則與肌管的肌纖維萎縮有著密切的關系[21]。這些差異表達的circRNA在面頸部顱神經損傷后肌萎縮纖維化的具體作用以及是否確實通過以上信號通路調控該進程，有待進一步的深入研究和驗證。