基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的耳聾左慈丸治療耳聾耳鳴作用機(jī)制研究△

蒲玉紅 朱仁愿 劉興國 程世紅 丁輝 焦娜 崔嘯

耳聾左慈丸是中醫(yī)治療耳聾耳鳴的經(jīng)典名方，收錄于2015年版《中國藥典》中，處方組成包括：磁石(煅)、熟地黃、山茱萸(制)、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉和竹葉柴胡等8味中藥；具有滋腎平肝之功效，用于肝腎陰虛，耳鳴耳聾，頭暈?zāi)垦1]。研究證實(shí)，耳聾左慈丸對藥物性聾[2]、突發(fā)性聾[3]、老年性聾[4，5]、耳鳴[6]、神經(jīng)性耳鳴[7]、中耳炎[8]等疾病均療效確切。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，耳聾左慈丸的療效研究已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞層面[9，10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合了系統(tǒng)藥理學(xué)、計算系統(tǒng)生物學(xué)、統(tǒng)計分析學(xué)等多學(xué)科的大數(shù)據(jù)技術(shù)，通過對化學(xué)成分、靶點(diǎn)、作用途徑的研究實(shí)現(xiàn)藥物作用的綜合網(wǎng)絡(luò)分析，已被廣泛用于中藥潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的預(yù)測及中藥作用機(jī)制的闡述[11]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對耳聾左慈丸治療耳聾耳鳴藥效作用進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫的選取及軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(http://tcmspw.com)；UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)；Cytoscape3.6.1軟件；Gene在線數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)；STRING11.0在線軟件(https://string-db.org)；David6.8在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)。

1.2耳聾左慈丸活性成分的篩選 采用TCMSP平臺，以耳聾左慈丸處方組成中的各味藥為關(guān)鍵詞檢索其含有的所有化學(xué)成分。然后根據(jù)藥物的藥物動力學(xué)(ADME)特性[即吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)、排泄(excretion)]中的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(druglikeness，DL)篩選出可能的活性化合物[12]。

1.3化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過TCMSP平臺檢索1.2中篩選出的活性化合物相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，將得到的靶點(diǎn)名稱輸入UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為人，通過UniprotKB搜索功能得到人的蛋白質(zhì)基因名稱。將活性化合物和相關(guān)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，從而構(gòu)建出耳聾左慈丸的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4耳聾耳鳴疾病靶蛋白蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Gene在線數(shù)據(jù)庫，以“耳聾(deafness)”、“耳鳴(tinnitus)”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)基因。為進(jìn)一步研究耳聾左慈丸靶點(diǎn)與耳聾耳鳴疾病靶點(diǎn)在蛋白水平上的互相作用關(guān)系，選取兩者交集的靶點(diǎn)蛋白輸入到STRING11.0在線軟件，物種設(shè)定為人，置信度設(shè)置為0.400，獲取蛋白相互作用信息，得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行分析。

1.5基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes andgenomes，KEGG)通路富集分析，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)路 將經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖篩選出的交集蛋白上傳至David 6.8在線數(shù)據(jù)庫功能進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析。采用 Cytoscape 3.6.1軟件將交集蛋白、與其相關(guān)聯(lián)的化合物及富集分析得到的信號通路構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1活性化合物及靶點(diǎn)的篩選 通過TCMSP平臺搜索耳聾左慈丸處方組成中各藥味含有的化合物，以O(shè)B≥30%，DL≥0.15為篩選條件[13]，經(jīng)去重復(fù)后篩選出活性化合物87個；繼而檢索每個活性化合物對應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)，結(jié)果顯示有55個化合物分別作用于235個靶點(diǎn)，其中32個化合物沒有相關(guān)靶點(diǎn)信息(表1)。

表1 87個活性化合物的分子編號、名稱、來源、口服生物利用度、類藥性及靶點(diǎn)數(shù)

2.2化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建得到化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1。網(wǎng)絡(luò)中交集290個節(jié)點(diǎn)和660條邊，耳聾左慈丸中共篩選出87個活性化合物，其中有32個化合物未找到相應(yīng)靶點(diǎn)，沒有參與網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，所以290個節(jié)點(diǎn)分別為55個化合物節(jié)點(diǎn)(用綠色圓形表示)和235個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)(以藍(lán)色菱形表示)。邊表示化合物與靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，耳聾左慈丸中每個活性化合物平均作用于12(660/55)個靶點(diǎn)，每個靶點(diǎn)平均所連接藥物的數(shù)量是2.81(660/235)，由此可以看出耳聾左慈丸是以多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同的方式發(fā)揮治療作用的。

圖1 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)能夠反映化合物-靶點(diǎn)的相互關(guān)系，一個節(jié)點(diǎn)所連接的線條個數(shù)稱之為度(degree)，度較大的節(jié)點(diǎn)在整個網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是關(guān)鍵的化合物或者靶點(diǎn)[14]。利用Cytoscape 3.6.1軟件中的Network Analyzer功能分析耳聾左慈丸化合物-靶點(diǎn)的度值，可以得出化合物中度排名前3位的化合物是槲皮素(quercetin，M98)、山奈酚(kaempferol，M422)和β-谷甾醇(Beta-sitosterol，M358)，分別能與154、63、39個靶點(diǎn)蛋白發(fā)生相互作用；靶點(diǎn)中度排名前3位的是核受體輔激活因子2(NCOA2)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)和前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)，分別能與28、26、18個化合物發(fā)生相互作用。

2.3耳聾耳鳴疾病PPI網(wǎng)絡(luò) 在Gene在線數(shù)據(jù)庫分別以“deafnes”、“tinnitus”為關(guān)鍵詞檢索到相關(guān)蛋白353個，經(jīng)篩選得出37個與耳聾左慈丸作用靶點(diǎn)交集的蛋白(表2)。將37個交集蛋白上傳至STRING 11.0在線軟件中，構(gòu)建耳聾耳鳴疾病PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)，其中8個蛋白(DCAF17、GSTP1、MTO1、SLC12A7、SLC19A2、SLC22A4、SLC44A4、SLC52A2)無相互作用關(guān)系。導(dǎo)出STRING數(shù)據(jù)，采用Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行分析可知，網(wǎng)絡(luò)中包括29個存在相互作用的蛋白節(jié)點(diǎn)和96條邊，degree值排名前列的蛋白節(jié)點(diǎn)有CALM1、COL4A3、COL2A1、COL11A2和GJA1，degree值均為7。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 37個與耳聾左慈丸作用靶點(diǎn)交集的蛋白信息

2.4GO富集與KEGG通路富集 采用Davidv 6.8在線數(shù)據(jù)庫對PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選的29個潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集和KEGG富集。

GO富集是對PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用進(jìn)行研究，根據(jù)錯誤發(fā)生率(false dis-covery rate，F(xiàn)DR)<0.05分析得到365個GO條目，表3列出前20條，其中與生物過程(biological process，BP)相關(guān)的條目11個，涉及聽覺、心率調(diào)節(jié)、心肌收縮調(diào)節(jié)、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)、系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)等方面；分子功能(molecular function，MF)相關(guān)的條目有2個，涉及細(xì)胞外間質(zhì)結(jié)構(gòu)組成和結(jié)構(gòu)分子活性；細(xì)胞組成(cellular component，CC)相關(guān)的條目有7個，涉及膠原三聚體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和閏盤等。

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的GO條目前20條的類別、編號、名稱、基因數(shù)及錯誤發(fā)生率(錯誤發(fā)生率<0.05)

KEGG富集主要是研究靶點(diǎn)蛋白在信號通路中的作用，根據(jù)FDR<0.05分析，得到26個與耳聾耳鳴疾病有關(guān)的KEGG條目，包括糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、FAS信號通路(focal adhesion)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用信號通路(ECM-receptor interaction)等(表4)，這些信號通路可能與耳聾耳鳴病理過程密切相關(guān)。

表4 PPI網(wǎng)絡(luò)中26個與耳聾耳鳴相關(guān)的KEGG條目編號、名稱、基因數(shù)及錯誤發(fā)生率(錯誤發(fā)生率<0.05)

2.5化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)(圖3)，圖中包括耳聾左慈丸化合物18個(以黃色三角形表示)，耳聾耳鳴疾病相關(guān)靶點(diǎn)20個(以橙色正六邊形表示)，信號通路26個(以紫色正方形表示)。根據(jù)degree值分析該網(wǎng)絡(luò)得出：化合物中，排名前3的是槲皮素、茵陳黃酮(areapillin，M4609)和山酮C(hancinone C，M5430)，來自于牡丹皮、柴胡和山藥；相關(guān)靶點(diǎn)中，處于前列的為鈣調(diào)蛋白1(CALM1)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素6(IL6)和酪氨酸蛋白磷酸酶非受體Ⅱ型(PTPN11)；主要集中的信號通路有糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、胰島素抵抗(insulin resistance)、抗葉酸(antifolate resistance)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路(neurotrophin signaling pathway)等。表明耳聾左慈丸的多種活性化合物通過作用于多個相關(guān)靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)多條信號通路的目的，繼而調(diào)控耳聾耳鳴病理過程的不同環(huán)節(jié)，最終發(fā)揮治療作用，這與中藥治療疾病的系統(tǒng)性和整體性的特點(diǎn)相符合。

圖3 化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

本研究利用TCMSP平臺檢索并篩選得到耳聾左慈丸中有87種活性化合物，其中55種化合物分別作用于235個靶點(diǎn)。利用Gene在線數(shù)據(jù)庫檢索到耳聾耳鳴疾病相關(guān)蛋白353個，將其與耳聾左慈丸的235個化合物靶點(diǎn)蛋白交集后得到耳聾左慈丸治療耳聾耳鳴作用靶點(diǎn)37個。將37個交集蛋白上傳至STRING11.0在線軟件中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)顯示8個蛋白無相互作用關(guān)系。對其余29個交集蛋白進(jìn)行GO富集和KEGG信號通路富集。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，耳聾左慈丸基因功能主要體現(xiàn)在聽覺、心率調(diào)節(jié)、心肌收縮調(diào)節(jié)、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)、系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)、細(xì)胞外間質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、結(jié)構(gòu)分子活性、膠原三聚體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和閏盤等方面。KEGG通路篩選得到26個與耳聾耳鳴疾病有關(guān)的條目，包括糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、FAS信號通路、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用信號通路等。構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，耳聾左慈丸中有18個活性化合物與治療耳聾耳鳴疾病的20個靶點(diǎn)蛋白存在較強(qiáng)的相互作用，這些靶點(diǎn)主要集中于26條信號通路。

化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)中，化合物包括槲皮素、茵陳黃酮、海風(fēng)藤酮(kadsurenone，M322)、豆甾醇(stigmasterol，M449)、β-谷甾醇(beta-sitosterol，M358)、常春藤皂苷元(hederagenin，M296)、山奈酚(kaempferol，M422)、異鼠李素(isorhamnetin，M354)、黃芩苷(Baicalin，M2776)、羥基芫花素(Hydroxygenkwanin，M5530)等18種。研究顯示，老年性聾、突發(fā)性聾、糖尿病性聾等耳聾耳鳴疾病的發(fā)病與血粘度異常、血脂異常、動脈硬化、糖尿病并發(fā)癥等存在相關(guān)性[15～18]；耳聾左慈丸的18種活性化合物中黃酮類成分槲皮素、茵陳黃酮、海風(fēng)藤酮、常春藤皂苷元、山奈酚、異鼠李素和黃芩苷具有顯著抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗血栓、降糖、降壓、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、心血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用和生物活性[19～26]，植物甾醇類成分β-谷甾醇和豆甾醇也具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇和中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用等[27，28]，表明耳聾左慈丸可能通過這18種活性化合物發(fā)揮治療耳聾耳鳴的作用。

陳學(xué)敏等[29]研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)噪聲刺激會導(dǎo)致耳蝸內(nèi)耳毛細(xì)胞鈣離子平衡失調(diào)，造成鈣超載從而損傷聽覺傳入神經(jīng)功能，而鈣離子通道阻滯劑可抑制噪聲引起的耳蝸毛細(xì)胞和聽覺系統(tǒng)的損傷。翟建光等[30]通過探究血清炎性因子及耳蝸組織神經(jīng)營養(yǎng)因子對老年性聾大鼠的影響發(fā)現(xiàn)，老年性聾與耳蝸組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6、sVCAM-1、VE-cadherin、HMGB1、NGF蛋白、NT-3蛋白、鈣蛋白酶及鈣蛋白酶mRNA均有密切關(guān)聯(lián)，其在老年大鼠耳蝸中的異常表達(dá)，對老年性聾的診斷、治療及預(yù)后有重要意義。許暉雁等[31]則發(fā)現(xiàn)PTPN11基因突變與聽力下降之間存在基因型-表型相關(guān)性，生殖細(xì)胞PTPN11基因突變可導(dǎo)致Noonan綜合征和多痣Noonan綜合征，兩癥患者聽力下降，多數(shù)表現(xiàn)為傳導(dǎo)性聾，多伴發(fā)分泌性中耳炎，亦有表現(xiàn)為感音神經(jīng)性聾、混合性聾。本研究結(jié)果顯示與耳聾耳鳴疾病相關(guān)的20個靶點(diǎn)中，處于前列的有CALM1、TNF、IL6和PTPN11，因此，推斷耳聾左慈丸中的活性化合物可能是通過作用于關(guān)鍵的靶點(diǎn)CALM1、TNF、IL6和PTPN11發(fā)揮治療作用。

研究顯示，AGE-RAGE信號通路在機(jī)體衰老過程中激活NF-κB活性使其轉(zhuǎn)位胞核中，繼而誘導(dǎo)產(chǎn)生多種損傷因子，如IL-1β、TNF-α等，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制蛋白，導(dǎo)致耳蝸神經(jīng)細(xì)胞的壞死及血管縮窄，最終使聽力下降[32]。PI3K-Akt信號通路的激活，可增加衰老神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化功能，增加線粒體堿基切除修復(fù)酶的表達(dá)，維持線粒體的生物合成功能，減少氧化應(yīng)激損害及抑制調(diào)亡反應(yīng)的發(fā)生，干預(yù)中樞性老年性聾的發(fā)生[33]；而胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)病的主要生理病理機(jī)制，長期IR將嚴(yán)重?fù)p傷PI3K/Akt信號級聯(lián)通路，導(dǎo)致下游靶點(diǎn)表達(dá)紊亂，進(jìn)而破壞能量代謝穩(wěn)態(tài)，并誘發(fā)蛋白過度磷酸化，造成糖尿病性聽力下降[34]。敖華飛等[35]研究發(fā)現(xiàn)葉酸缺失形成的高同型半胱氨酸血癥可能是全聾型突發(fā)性聾的一個危險因素。陳菲等[36]采用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合注射用鼠神經(jīng)生長因子治療突發(fā)性聾，療效顯著，可能是因?yàn)槭笊窠?jīng)生長因子可以抑制耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡缺失及血管紋的退化變性變薄，對年齡相關(guān)性聾和突發(fā)性聾具有保護(hù)作用；周爽等[37]通過研究膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)在耳鳴大鼠模型下丘中的表達(dá)及作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，耳鳴大鼠下丘GDNF及其受體RET、P-PI3K p85α、P-AKT蛋白水平低于健康對照組，表明GDNF對耳鳴有抑制作用。本研究顯示耳聾耳鳴疾病相關(guān)生物學(xué)信號通路有26條，由此預(yù)測，耳聾左慈丸中多種化合物通過作用于多個靶點(diǎn)、調(diào)控26條生物學(xué)信號通路，從而達(dá)到治療耳聾耳鳴的作用。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度，初步闡述了耳聾左慈丸治療耳聾耳鳴疾病的活性成分、潛在靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的關(guān)鍵生物學(xué)信號通路，為進(jìn)一步深入研究其藥理作用機(jī)制提供了參考。