IL-6基因多態(tài)性與帕金森病預(yù)后的關(guān)系

張英麗，王維，譚淑慧

（聊城市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 聊城252004）

目前，關(guān)于帕金森病發(fā)生的病理學(xué)研究認(rèn)為，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡導(dǎo)致機體神經(jīng)運動功能障礙，從而出現(xiàn)典型的帕金森病臨床表現(xiàn)[1]。然而，導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡和帕金森病發(fā)生的起始因素尚不清楚[2-3]。大量流行病學(xué)研究認(rèn)為，其發(fā)生機制可能與環(huán)境、遺傳等因素的相互作用有關(guān)[4]。近年來，隨著基因測序技術(shù)的成熟和普及，研究發(fā)現(xiàn)基因中存在大量的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP），且SNP 與多種疾病的發(fā)生存在密切相關(guān)性[5-6]。例如，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分化蛋白sept14基因的SNP 位點rs73701167 與魯西南地區(qū)漢族人群帕金森病的發(fā)生具有密切相關(guān)性，其中等位基因C 可能是發(fā)病的重要危險因素。亦有研究認(rèn)為PITX3基因多態(tài)性與帕金森病存在密切相關(guān)性[7]。因此，探尋帕金森病發(fā)生、發(fā)展和治療預(yù)后相關(guān)的SNP，對帕金森病的治療和療效評估具有重要意義。為此，本文探討IL-6基因rs1800796 多態(tài)性與帕金森病預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月—2019年12月聊城市人民醫(yī)院就診的帕金森病患者80 例作為帕金森病組，同期收集本院體檢的健康志愿者50 例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、體征和影像學(xué)表現(xiàn)，確診為帕金森?。虎诨颊叻厦蓝喟胖委熯m應(yīng)證；③患者及家屬了解研究內(nèi)容和目的，愿意配合本調(diào)查研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者存在慢性炎癥疾病，尤其是IL-6水平的異常升高現(xiàn)象；②患者存在嚴(yán)重的心肺肝腎功能不全疾病。兩組研究對象的性別構(gòu)成、年齡、收縮壓及舒張壓比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組研究對象一般臨床資料的比較

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器超低溫-80℃冰箱（上海輔澤商貿(mào)有限公司），垂直層流超凈工作臺（濟南博航科學(xué)儀器有限公司），全自動RT-PCR 儀（美國ABI 公司），低速離心機（上海翊圣生物科技有限公司），15 ml 離心管、20 ml 量筒、震蕩器、吸水紙等。

1.2.2 等位基因鑒別首先抽取兩組研究對象肘靜脈血2 ml，置于含有乙二胺四乙酸二鈉（ethyl‐ene-diamine-tetra-acetate，EDTA）的抗凝管中，采用人外周血DNA 提取試劑盒（上海生工生物科技有限公司） 提取各研究對象基因組DNA。通過NCBI gene 數(shù)據(jù)庫檢索IL-6的基因序列，采用primer 5 軟件設(shè)計覆蓋C-572G 位點正反向的特異性引物，正向：5'-CGACGCGCTCAGTCCCGGTG-3'，反向：5'-GTCGCCACGTTGCACCCTAG-3'，長度為20 bp。采用Takara Taq 酶進行PCR 反應(yīng)擴增目的片段，反應(yīng)體系10 μl，其中：DNA 模板0.4 μl，Taq DNA聚合酶0.5 μ l，mix 反應(yīng)液2 μ l，正反向引物各0.2 μl，加入ddH2O 至10 μl。PCR 程序為：94℃預(yù)變性10 min，然后進入40 次PCR 循環(huán)，具體條件如下：94℃變性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸10 min。隨后將上述PCR 產(chǎn)物再次進行純化、擴增和測序。測序結(jié)果采用Sequencer 5.0 Demo 軟件讀取。

1.3 觀察指標(biāo)

分別采用帕金森病綜合評分（Unified Parkinson's Disease Rating Scale, UPDRS）、簡易精神狀態(tài)評價量表（Mini-Mental State Examination,MMSE）、蒙特利爾認(rèn)知量表（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）和帕金森病生活質(zhì)量問卷（39-item Par- kinson disease questionnaire, PDQ-39）評價患者經(jīng)美多芭治療后的療效。

UPDRS 分為4 個維度，即精神行為和情緒，日?；顒樱\動功能，治療的并發(fā)癥，下設(shè)42 個條目，其中前3 個維度均采用5 級評分法（0～4 分），分值與癥狀嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

MMSE 分為5 個維度，即定向力、語言能力、注意力和計算力、記憶力，分值分別為10、9、5、3、3 分，總分30 分，分值與認(rèn)知功能障礙程度呈負(fù)相關(guān)，分?jǐn)?shù)＜27 分則為認(rèn)知功能障礙。

MoCA 分為執(zhí)行功能、記憶、視空間技能、注意與集中、抽象思維、語言、計算和定向力，總分30 分，分值與認(rèn)知障礙程度呈負(fù)相關(guān)，＜26 分則為認(rèn)知障礙。

PDQ-39 量表共分為8 個維度，即認(rèn)知、身體活動、精神健康、交流、日常生活行為、社會支持、屈辱感、身體不適，下設(shè)39 個條目，每個條目均為五級評分法（0～4 分），分值與生活質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗。通過比值比（）預(yù)測基因型及等位基因與帕金森病易感性之間的關(guān)系。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-6 基因C-572G 位點（rs1800796）基因多態(tài)性的比較

根據(jù)表2可知，80 例帕金森病患者中，CC 型30 例，CG 型27 例，GG 型23 例；而50 例正常志愿者中CC 型31 例，CG 型15 例，GG 型4 例。帕金森病組和對照組基因多態(tài)性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中，CC型對照組高于帕金森病組，CG 型和GG 型帕金森病組高于對照組。帕金森病組和對照組等位基因比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中，等位基因C 頻率對照組高于帕金森病組，等位基因G 頻率帕金森病組高于對照組。

表2 IL-6基因C-572G位點（rs1800796）基因多態(tài)性的比較 例（%）

2.2 不同IL-6 基因C-572G 位點（rs1800796）基因多態(tài)性血清IL-6水平的比較

CC 組、CG 組、GG 組患者血清IL-6 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與CC 組比較，CG 組、GG 組IL-6 水平較高（t=13.613 和18.989，均P=0.000）；與CG 組比較，GG 組水平較高（t=10.100，P=0.000）。見表3。

表3 IL-6基因C-572G位點（rs1800796）多態(tài)性帕金森病患者血清IL-6水平的比較 （pg/ml，±s）

表3 IL-6基因C-572G位點（rs1800796）多態(tài)性帕金森病患者血清IL-6水平的比較 （pg/ml，±s）

組別n IL-6 CC型CG型GG型F 值P 值30 27 23 3.8±0.6 8.5±1.8 14.3±2.9 13.125 0.000

2.3 L-6基因C-572G位點（rs1800796）多態(tài)性帕金森病患者美多芭治療前后評分比較

80 例帕金森病患者經(jīng)美多芭治療前，CC 型、CG型、GG 型患者UPDRS、PDQ-39、MMSE 和MoCA 評分比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；與CC 型比較，CG 型、GG 型UPDRS、PDQ-39、MMSE 和MoCA 評分均較高（P ＜0.05）；與CG型比較，CC 型UPDRS、PDQ-39、MMSE 和MoCA 評分較低，GG 型較高（P ＜0.05）。見表4。

表4 IL-6基因C-572G 位點（rs1800796）多態(tài)性帕金森病患者治療前的評分比較 （±s）

表4 IL-6基因C-572G 位點（rs1800796）多態(tài)性帕金森病患者治療前的評分比較 （±s）

注：①與CC型比較，P ＜0.05；②與CG型比較，P ＜0.05。

組別n MoCA UPDRS PDQ-39 MMSE CC型CG型GG型F 值P 值20.33±1.73 21.87±1.85①23.51±1.96①②15.128 0.000 30 27 23 42.38±5.32 45.52±5.85①47.76±5.96①②13.278 0.000 59.2±5.9 63.5±5.8①67.8±5.3①②17.298 0.000 20.52±1.35 21.43±1.52①22.65±1.67①②8.165 0.011

80 例帕金森病患者經(jīng)美多芭治療后，CC 型、CG 型、GG型患者UPDRS、PDQ-39、MMSE 和MoCA 評分比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；與CC 型比較，CG 型、GG 型UPDRS、PDQ-39、MMSE 和MoCA 評分均較高（P ＜0.05）；與CG 型比較，CC 型UPDRS、PDQ-39、MMSE 和MoCA 評 分較低，GG 型較高（P ＜0.05）。見表5。

表5 L-6基因C-572G 位點（rs1800796）多態(tài)性帕金森病患者治療后的評分比較 （±s）

表5 L-6基因C-572G 位點（rs1800796）多態(tài)性帕金森病患者治療后的評分比較 （±s）

注：①與CC型比較，P ＜0.05；②與CG型比較，P ＜0.05。

組別n MoCA UPDRS PDQ-39 MMSE CC型CG型GG型F 值P 值17.12±1.05 19.25±1.34①20.63±1.56①②12.977 0.000 30 27 23 30.26±3.28 35.51±3.86①39.75±4.27①②12.123 0.000 32.49±2.85 38.72±3.12①46.65±3.23①②13.505 0.000 16.25±0.87 18.36±0.95①20.18±0.93①②7.123 0.008

3 討論

帕金森?。≒arkinsons disease, PD）又稱震顫麻痹，主要表現(xiàn)為靜止時手顫抖、運動遲緩、肌強直和姿態(tài)不穩(wěn)，是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的退行性疾病之一，其臨床發(fā)病率高居神經(jīng)退行性疾病的第2位，嚴(yán)重威脅老年人的健康和生活質(zhì)量，尤以65歲以上的老年人群更為嚴(yán)重[8-9]。目前，關(guān)于帕金森病發(fā)生的具體病因、分子生物學(xué)機制均不是很清楚，但研究均認(rèn)為其發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用所致，故大量臨床流行病學(xué)研究主要針對遺傳基因和環(huán)境因素兩方面進行探索[10]。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是基因組水平上由于單個核苷酸的突變所致的DNA 序列改變[11]。SNP 是人類可遺傳變異中最常見的一類，在人類基因組中廣泛存在，盡管只是單個核苷酸改變，但特殊部位的核苷酸改變可對整個編碼基因的穩(wěn)定性、生物學(xué)活性產(chǎn)生重要的影響，甚至導(dǎo)致特殊疾病的發(fā)生[12]。例如，在糖尿病中，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的+869T/C 位點多態(tài)性具有增強TGF-β1穩(wěn)定性作用，突變患者具有較高的TGF-β1水平，極易誘發(fā)胰島素抵抗和胰島細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[13]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)機體慢性炎癥反應(yīng)與帕金森病的發(fā)生密切相關(guān)[14]。白細(xì)胞介素-6（IL-6）是調(diào)控機體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答較為重要的炎癥因子之一[15]。有研究報道IL-6 與機體運動存在對應(yīng)關(guān)系，即IL-6 水平隨人體離心運動而改變[16]。同時，IL-6 具有促進神經(jīng)元修復(fù)的作用，而在腦膠質(zhì)瘤中，異常高表達(dá)的IL-6 具有促進腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、抗凋亡等生物學(xué)作用[17-18]。在帕金森病中，部分研究發(fā)現(xiàn)帕金森病患者存在異常高表達(dá)的IL-6 水平，盡管IL-6 具有促進神經(jīng)元修復(fù)功能，但高水平的IL-6 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可加重神經(jīng)元的損傷，加重帕金森病患者的病情[19-20]。而且，已有研究發(fā)現(xiàn)帕金森病的治療可有效降低患者IL-6 水平，如補腎活血通絡(luò)方劑治療可有效改善老年帕金森病、癡呆患者認(rèn)知功能、生活質(zhì)量，降低患者腦脊液IL-6 水平[21]。

鑒于異常高表達(dá)的IL-6 在帕金森病發(fā)生、發(fā)展中可能具有的促進作用，進一步針對IL-6 的SNP進行探索[22]。C-572G 是目前IL-6 研究最多的SNP位點之一，即IL-6基因組第572 胞嘧啶可突變?yōu)轼B嘌呤。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)該位點突變可導(dǎo)致IL-6水平的異常升高[23]。分析認(rèn)為C-572G 位點多態(tài)性位于IL-6啟動子5'側(cè)翼區(qū)，鳥嘌呤突變后可能具有促進IL-6轉(zhuǎn)錄的作用[24]。而且，已有研究報道了IL-6C-572G 多態(tài)性位點與自發(fā)性早產(chǎn)密切相關(guān)[25]。

鑒于上述分析，本研究首先針對IL-6C-572G位點多態(tài)性與帕金森病是否存在相關(guān)性進行探討。研究發(fā)現(xiàn)帕金森病患者IL-6基因C-572G 位點（rs1800796）CC 野生型和等位基因C 頻率均低于對照組，而GG 純合型和等位基因G 頻率均高于對照組。進一步針對IL-6基因C-572G 位點（rs1800796）的發(fā)病風(fēng)險進行比較，CC 野生型的發(fā)病優(yōu)勢比僅為0.605，而CC 純合型的發(fā)病優(yōu)勢比高達(dá)3.593。單獨比較等位基因C 和G 頻率，其優(yōu)勢比分別為0.701 和2.093。上述結(jié)果證實IL-6C-572G 位點（rs1800796）鳥嘌呤突變患者存在更高的帕金森病發(fā)病風(fēng)險。

本研究發(fā)現(xiàn)純合型GG 患者血清IL-6 水平明顯高于野生CC 型患者，證實IL-6C-572G 位點（rs1800796）的突變可導(dǎo)致更高水平的IL-6，該結(jié)論與既往關(guān)于IL-6C-572G 位點（rs1800796）研究的論斷一致。

本研究結(jié)果顯示，帕金森病患者治療后MMSE與MoCA 評分均有顯著下降，同時帕金森病相關(guān)量表UPDRS、PDQ-39、MMSE 和MoCA 評分CC 型最低，CG型次之，而GG型最高，證實IL-6基因C-572G位點（rs1800796）多態(tài)性與帕金森病預(yù)后存在密切的關(guān)系。

綜上可知，通過對IL-6基因C-572G 位點（rs1800796）多態(tài)性的檢測，有助于對帕金森病發(fā)病風(fēng)險和治療預(yù)后的評估。