上調(diào)SERCA2a基因?qū)β孕牧λソ叽笫蟮淖饔眉皺C制

陳磊 吳小燕

(海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，海南 ?？?570100)

慢性心力衰竭是多種心臟疾病終末狀態(tài)，當心肌細胞發(fā)生衰竭后會導致多種生物過程發(fā)生改變，其中較為重要的表現(xiàn)之一為肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)控障礙〔1〕。已有研究證實在心力衰竭患者和心力衰竭動物模型的心肌細胞中心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)2a活性顯著降低，且其表達水平顯著低于在正常心肌細胞中的表達，目前臨床上認為SERCA2a活性降低和表達下降和肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)控障礙是導致心臟收縮、舒張功能異常的原因之一〔2,3〕。本研究中通過建立慢性心力衰竭大鼠模型，構建SERCA2a基因慢病毒載體，研究上調(diào)SERCA2a基因?qū)β孕牧λソ叽笫蟮淖饔眉皺C制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取SPF級SD健康大鼠40只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，鼠齡(3.9±0.6)個月，體重(225.8±11.5)g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時間1 w。本研究所做實驗均獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

主要試劑：小鼠抗大鼠PLB抗體(上海優(yōu)寧維生物科技有限公司)，小鼠抗大鼠GRP78抗體(廣州市格瑞林生物科技有限公司)，兔抗大鼠p-JNK抗體(SANTA CRUZ公司)，兔抗人Caspase-12抗體(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1慢病毒載體構建 SERCA2a表達上調(diào)的慢病毒載體構建及測定大鼠SERCA2a的序列查找和設計由廣州易錦公司完成。重組的LV-SERCA2a和LV-SERCA2a(抑制載體)慢病毒表達載體由廣州易錦公司合成，并經(jīng)測序進行驗證。之后行慢病毒滴度測定，制備完成后重組慢病毒在-80℃下保存。

1.2.2建模 隨機選取40只小鼠中的10只作為正常組，另外30只小鼠建立參照Ahemed等〔4〕研究實驗中腹腔注射阿霉素的方法建立慢性心力衰竭大鼠模型，將阿霉素配制成2 mg/ml的溶液連續(xù)6 w注射于大鼠腹腔(4 mg/kg)，使用10%水合氯醛注射于大鼠腹腔進行麻醉處理，之后使得大鼠仰臥在操作臺上，并作固定，剃除大鼠胸前區(qū)毛發(fā)，測定心臟左室射血分數(shù)(LVEF)，當LVEF<60%時則表示慢性心力衰竭大鼠模型建立成功。將建模成功的30只慢性心力衰竭大鼠隨機分為模型組、下調(diào)組、上調(diào)組各10只。在建模成功后，將10 μl重組的LV-SERCA2a慢病毒懸液(病毒滴度為108TU/ml)在無菌環(huán)境下注射至上調(diào)組大鼠心臟中，將10 μl LV-SERCA2a(抑制載體)慢病毒懸液(病毒滴度為108TU/ml)在無菌環(huán)境下注射至下調(diào)組大鼠心臟中，正常組、模型組大鼠不做任何處理。

1.2.3樣本采集 采用斷頭法處死，立即取大鼠心肌組織，將提取的組織制作標本，使用40 ml/L的多聚甲醛進行固定，常溫下使用15%的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，每組各7份心肌組織樣本。其中1份心肌組織樣本作病理組織學觀察；取其中4份心肌組織，剪碎放置于器皿中，之后將5 ml 25%的膠原酶Ⅱ加入，將心肌細胞分離出待用；另外2份作后續(xù)研究指標檢測。

1.2.4病理組織學觀察 取1份心肌組織樣本后行蘇木素-伊紅(HE)染色處理，之后使用顯微鏡觀察大鼠心肌組織病理變化。

1.2.5心功能檢測 使用10%水合氯醛注射于各組剩余2只大鼠腹腔行麻醉處理，待麻醉后剃除大鼠局部毛發(fā)，使用高分辨率小動物超聲系統(tǒng)對四組大鼠左心室舒張、收縮末內(nèi)徑(LVEDD、LVESD)、LVEF及左心室短軸縮短率(FS)，測量連續(xù)完整的4個心動周期，取平均值。

1.2.6血流動力學檢測 在大鼠心功能檢測后，將右側頸動脈分離出，行氣管插管，之后氣管通過壓力傳感器和多導生理監(jiān)護儀相連接，當波形穩(wěn)定后逆行將導管插入大鼠左心室，對四組大鼠左心室收縮、舒張末壓(LVESP、LVEDP)及左心室內(nèi)壓上升、下降速率(±dp/dt)。

1.2.7心肌細胞中Ca2+濃度檢測 取2份分離出的心肌細胞放置于溫度為37℃水中行水浴處理，之后使用鈣熒光染料(Fluo/AM)避光孵育，孵育時間為1 h，之后在轉(zhuǎn)速為3 000 r/min的離心機中離心處理1 min，去除負載液，并使用生理記錄液反復洗滌3次。使用激光共聚焦顯微鏡對形態(tài)完成、染色效果較好的細胞進行掃描，心肌細胞中熒光值(鈣離子濃度)測定：激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為520 nm。之后使用計算機將圖像處理，得到細胞內(nèi)分布圖。最后經(jīng)過系統(tǒng)分析、換算出心肌細胞中Ca2+濃度。

1.2.8心肌細胞凋亡檢測 使用TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡數(shù)量，TUNEL陽性細胞形態(tài)學表現(xiàn)為細胞胞體變小，細胞核固縮，染色質(zhì)凝聚，呈現(xiàn)為黃褐色或者黃色顆粒，出現(xiàn)明顯的為凋亡細胞凋亡特征。

1.2.9蛋白檢測 使用Western印跡檢測四組大鼠心肌組織中受磷蛋白(PLB)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78、凋亡蛋白CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白-磷酸化的c-Jun氨基末端激酶-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CHOP-p-JNK-Caspase)-12通路蛋白表達量，將采集到的標本，研磨后加入蛋白緩沖液，進行常規(guī)蛋白提取，采取二喹啉甲酸(BCA)法進行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(PLB、GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12按照1∶1 000比例進行稀釋)，在4℃的環(huán)境中過夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(PLB、GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12按照1∶5 000比例進行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入電化學發(fā)光液，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。設置內(nèi)參蛋白為是GAPDH。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠心肌病理組織學觀察 正常組大鼠心肌纖維結構清晰、排列整齊，可見有心肌細胞呈圓形，心肌無萎縮、壞死、炎細胞浸潤，病理分級為0級。模型組大鼠心肌纖維結構模糊，排列不規(guī)則、紊亂，出現(xiàn)心肌纖維萎縮、液化性溶解及斷裂等，細胞核固縮，心肌間質(zhì)可見有增生的結締組織和炎細胞浸潤，病理分級為Ⅱ級。下調(diào)組大鼠心肌結構模糊，排列混亂，心肌出現(xiàn)萎縮、纖維化現(xiàn)象，心肌纖維斷裂，血管壁增厚，病理分級為Ⅱ～Ⅲ級。上調(diào)組大鼠心肌排列相比模型組和下調(diào)組稍微規(guī)整，無較為明顯可見的心肌萎縮、壞死等病理性改變，心肌間質(zhì)無水腫，但存在輕度的結締組織增生，病理分級為Ⅰ級。見圖1。

2.2各組心功能比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠LVEDD明顯升高，LVEDD、LVEF、FS明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組大鼠LVEDD明顯升高，LVEDD、LVEF、FS明顯降低，上調(diào)組大鼠LVEDD明顯降低，LVEDD、LVEF、FS明顯升高(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠LVEDD明顯降低，LVEDD、LVEF、FS明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組血流動力學比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠LVEDP明顯升高，LVESP、+dp/dt、-dp/dt明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組大鼠LVEDP明顯升高，LVESP、+dp/dt、-dp/dt明顯降低，上調(diào)組大鼠LVEDP明顯降低，LVESP、+dp/dt、-dp/dt明顯升高(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠LVEDP明顯降低，LVESP、+dp/dt、-dp/dt明顯升高(P<0.05)。見表2。

圖1 各組大鼠心肌病理組織學觀察(HE，×200)

表1 各組心功能比較

表2 各組血流動力學比較

2.4各組心肌細胞凋亡情況比較 與正常組〔(0.35±0.07)%〕相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高〔(17.56±3.12)%、(20.12±5.24)%、(9.45±2.01)%，P<0.05〕；與模型組相比，下調(diào)組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高，上調(diào)組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組心肌細胞凋亡情況比較(TUNEL，×200)

2.5各組心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中PLB、GRP78、CHOP-JNK-Caspase-12通路蛋白表達量比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達明顯升高，PLB蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組大鼠心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達明顯升高，PLB蛋白表達明顯降低，上調(diào)組大鼠心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達明顯降低，PLB蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達明顯降低，PLB蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 各組心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中PLB、GRP78、CHOP-JNK-Caspase-12通路蛋白表達比較

圖3 Western印跡檢測各組心肌組織中PLB、GRP78、CHOP-p-JNK-Caspase-12通路

3 討 論

慢性心力衰竭發(fā)生的主要病理機制為肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)控障礙，因此通過對SERCA2a基因進行傳導來對肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)控障礙改善目前已經(jīng)成為目前臨床上慢性心力衰竭基因治療靶點〔5,6〕。

心肌收縮過程中的Ca2+其主要來源為心肌肌漿網(wǎng)(SR)，SR上的鈣泵將存在于心肌細胞胞質(zhì)中的Ca2+重新攝回存儲，為下次心肌收縮提供鈣〔7〕。在正常機體狀態(tài)下SERCA2a主要存在于心肌、骨骼肌慢肌纖維中，當胞質(zhì)中的Ca2+濃度顯著增加后會活SERCA2a，最終將細胞胞質(zhì)Ca2+攝入SR中〔8,9〕。當慢性心力衰竭發(fā)生后會導致心肌組織中SERCA2a蛋白表達量降低，影響SERCA2a功能障礙，進而影響SR攝取Ca2+障礙，導致心肌細胞胞質(zhì)中的Ca2+濃度降低，對心肌收縮期的Ca2+釋放產(chǎn)生影響，最終導致心肌收縮功能發(fā)生障礙〔10～12〕。本研究結果說明上調(diào)SERCA2a基因可在一定程度上提高心肌細胞中Ca2+濃度，改善慢性心力衰竭大鼠心肌收縮、舒張功能，最終改善大鼠心功能。

根據(jù)目前臨床上現(xiàn)有的研究〔13〕顯示，上調(diào)SERCA2a基因?qū)π募∷ソ叩淖饔猛緩捷^多，一方面通過上調(diào)SERCA2a基因可增加大鼠心肌組織中SERCA2a活性和表達，直接對慢性心力衰竭大鼠心肌收縮、舒張功能進行改善；另一方面通過上調(diào)SERCA2a基因可改善心肌衰竭的能量代謝，進而降低心肌細胞的耗氧量；此外，上調(diào)SERCA2a基因可減弱心肌細胞凋亡、重構、肥厚等。目前研究認為導致心功能不全和心肌衰竭較為重要的因素為心肌細胞凋亡〔14～16〕。心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡有多種途徑，目前已被證實在缺血性心臟病和心力衰竭中的有著重要的作用〔17,18〕。心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡的途徑較多，在多種凋亡途徑中，主要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性途徑，包括CHOP-JNK-Caspase-12通路〔19〕。當心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡發(fā)生后會誘導CHOP的高表達，屬于心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡中的特異性轉(zhuǎn)錄因子；Caspase家族中的成員較多，目前臨床上將其分為凋亡起始因子和執(zhí)行因子，其中Caspase-12在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中所產(chǎn)生，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中所特有的因子，在內(nèi)凋亡途徑和外凋亡途徑中均不會被降解，屬于心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡中的關鍵因子，僅在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡時被激活〔19,20〕。本研究結果提示，上調(diào)SERCA2a基因可能時通過抑制心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的CHOP-JNK-Caspase-12凋亡信號通路，起到改善大鼠心肌功能的作用。

綜上，上調(diào)SERCA2a可有效改善慢性心力衰竭大鼠心功能，其機制可能和抑制心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的心肌凋亡有關。