血尿清膠囊對(duì)IgA腎病模型大鼠腎組織中MMP-9及TIMP-1表達(dá)的影響

金迪 張守琳 鄒迪

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

IgA腎病(IgAN)占國內(nèi)外原發(fā)性腎小球疾病的43.45%，發(fā)病率最高〔1〕，以IgA、IgG免疫復(fù)合物沉積在腎小球系膜區(qū)為特點(diǎn)。IgAN最初被認(rèn)為是良性原發(fā)性腎小球疾病，但越來越多的臨床研究數(shù)據(jù)表明，在確診后的20～30年里將有30%～40%的IgAN患者發(fā)展至終末期腎臟病(ESRD)〔2〕。血尿清膠囊是長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有滋陰補(bǔ)腎、清熱利濕、涼血止血的作用。臨床應(yīng)用近20年，取得了顯著效果，本研究旨在探討血尿清膠囊治療IgAN的療效及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇6～8周齡，SPF級(jí)雄性SD大鼠，共80只，體重(180±20) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供〔許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006〕。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及藥物 全自動(dòng)尿液分析儀URIT-1500購自上海三葳醫(yī)療設(shè)備有限公司；熒光素標(biāo)記兔抗大鼠IgA抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；四氯化碳(CCl4)購自北京化學(xué)試劑廠；電子秤TD10002A購自余姚市金諾儀器有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒、金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20180620A，規(guī)格96T/盒)購自美國RD公司；血尿清膠囊(墨旱蓮、車前草、小薊、蒲黃、三七)，批號(hào)：20180608，由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心制備提供；腎炎康復(fù)片(國藥準(zhǔn)字Z10940034)購自天津同仁堂集團(tuán)股份有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1造模方法 參照陸慧渝等〔3〕報(bào)道的方法制備IgAN動(dòng)物模型；將BSA以蒸餾水配成100 g/L的濃度，從實(shí)驗(yàn)第1天開始以BSA 400 mg/kg(4 ml/kg)灌胃，隔日1次，共8 w；皮下注射CCl4 0.1 ml+蓖麻油0.3 ml，1次/w，共9 w；于第6周尾靜脈注射LPS 0.05 mg/只(以0.9%NaCl配成溶液0.25 g/L，0.2 ml/只)。第9周各組隨機(jī)選取2只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠取腎組織，經(jīng)蘇木素-伊紅染色(HE)及免疫組化觀察證實(shí)IgA造模是否成功。

1.3.2分組及給藥 第9周驗(yàn)證IgAN大鼠模型成功后，將大鼠隨機(jī)分成模型組、血尿清膠囊高、中、低劑量組、腎炎康復(fù)片組。第10～16周給予藥物治療給予空白組和模型組每只大鼠2 ml/(kg·d)生理鹽水灌胃；血尿清膠囊高、中、低劑量組分別給予血尿清膠囊2 ml/(kg·d)灌胃〔相當(dāng)于生藥量0.648 g/(kg·d)、0.324 g/(kg·d)、0.162 g/(kg·d)〕；對(duì)照組給予腎炎康復(fù)片2 ml/(kg·d)灌胃〔相當(dāng)于生藥量0.648 g/(kg·d)〕。療程共8 w。

1.3.3觀測(cè)指標(biāo) 觀察大鼠治療前后的一般狀態(tài)，檢測(cè)治療前后各時(shí)相尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、24 h尿蛋白定量(UTP)及治療后腎組織中MMP-9、TIMP-1含量。

1.3.4標(biāo)本收集方法 將大鼠于0、4、6、8、10、12、14、16 w末放于代謝籠中收集24 h尿液，觀察尿液顏色變化，記錄尿量，應(yīng)用磺基柳酸法檢測(cè)UTP；應(yīng)用尿沉渣計(jì)數(shù)法測(cè)定尿RBC；給予藥物治療結(jié)束后，處死大鼠，取腎臟，采用ELISA(具體詳見試劑盒說明)檢測(cè)腎組織中MMP-9、TIMP-1含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中，空白組死亡2只，模型組死亡6只。空白組大鼠始終狀態(tài)良好，第6周開始造模組大鼠出現(xiàn)食欲差，乏力嗜睡倦怠，毛色晦暗，尿色加深，體重下降。給藥后，血尿清膠囊高、中、低劑量組和腎炎康復(fù)片組大鼠癥狀開始好轉(zhuǎn)。

2.2大鼠各時(shí)相尿RBC水平比較 空白組大鼠尿檢正常，其余各組大鼠自第6周開始尿RBC升高，自第10周起，各治療組大鼠尿RBC明顯較模型組下降(P<0.05)，血尿清膠囊中劑量組明顯優(yōu)于腎炎康復(fù)片組(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠各時(shí)相尿RBC水平比較個(gè)/HP)

2.3大鼠各時(shí)相UTP水平比較 空白組大鼠尿檢正常，其余各組大鼠自第6周開始UTP升高，自第10周起各治療組大鼠UTP明顯較模型組下降(P<0.05)，血尿清膠囊中劑量組明顯優(yōu)于腎炎康復(fù)片組(P<0.05)，見表2。

2.4各組腎組織中MMP-9、TIMP-1水平比較 與空白組比較，模型組大鼠MMP-9水平明顯下降，TIMP-1水平明顯上升，MMP-9/TIMP-1比值明顯降低(均P<0.05)；與模型組比較，各治療組MMP-9水平明顯上升，TIMP-1水平明顯下降，MMP-9/TIMP-1比值明顯上升，以血尿清膠囊中劑量組變化更為明顯(均P<0.05),且明顯優(yōu)于腎炎康復(fù)片組(P<0.05)。見表3。

表2 大鼠各時(shí)相UTP水平比較

表3 各組腎組織中MMP-9，TIMP-1水平比較

3 討 論

IgAN以血尿、蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)。對(duì)于腎小球源性血尿合并蛋白尿>1.0 g/d以上者，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)阻斷劑、激素聯(lián)合免疫抑制劑為主治療，而對(duì)于單純性血尿尚無有效的治療方法。中醫(yī)藥治療血尿，較之西藥治療有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，臨床療效較好、副作用小，不僅能控制血尿，同時(shí)能有效改善患者的腰痛、乏力等臨床癥狀?！澳蜓薄澳缪笔茄蛟谥嗅t(yī)里的名稱。多半以上的醫(yī)生認(rèn)為引起血尿病因病理主要是濕熱，故多以清熱利濕、涼血止血為主要治病原則。但血尿極易反復(fù)發(fā)作，病情纏綿難愈，其根本原因在于“久病多虛”“久病多瘀”，慢性腎炎患者由于長期血尿傷及腎臟，不僅存在“下焦?jié)駸帷?，同時(shí)還存在腎陰虧虛、瘀血阻絡(luò)的病理機(jī)制，由于單純注重清熱涼血以治其標(biāo)，而忽略了滋陰補(bǔ)腎扶其本，造成血尿反復(fù)經(jīng)久不愈。血尿清膠囊是長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老中醫(yī)經(jīng)過多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)研制而成，歷經(jīng)20年的臨床應(yīng)用，療效顯著，能夠有效降低血尿及蛋白尿。早蓮草能涼血止血，同時(shí)入肝腎二經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎，固本培元，使水旺則火自熄的作用，為君藥；小薊能清下焦熱，有止血、散瘀解毒的功效；梔子苦寒，清熱瀉火，除煩利濕，涼血以止血，二者共為臣藥，既能助君藥涼血止血，同時(shí)還能破瘀生新，保精養(yǎng)血，使止血而不留瘀；佐使藥為蒲黃、三七、車前草，有化瘀涼血止血的作用；諸藥合用，攻補(bǔ)兼施，共奏滋陰補(bǔ)腎以扶正，清熱涼血止血，化瘀通絡(luò)的作用，使止血而不留瘀。

IgAN的發(fā)病往往是由多種原因共同作用的結(jié)果。目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解酶系統(tǒng)紊亂，會(huì)引起ECM積聚導(dǎo)致進(jìn)行性腎小球硬化(GS)和間質(zhì)纖維化(TIF)，最終進(jìn)入ESRD〔4，5〕。而MMP-9是調(diào)節(jié)ECM的最重要的酶〔6，7〕，TIMP-1是一種主要抑制腎臟ECM降解導(dǎo)致GS的酶〔8～10〕。TIMP-1與 MMP-9以1∶1形成MMP-TIMP復(fù)合物，阻斷MMP-9與底物結(jié)合，從而影響ECM積聚和降解平衡〔11，12〕,TIMP-1/MMP-9任何兩者間的比例失衡都可能使ECM異常聚積，引發(fā)腎小球疾病，導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)重塑，血尿和蛋白尿形成。因此維持 MMPs/TIMPs系統(tǒng)平衡顯得非常重要。

本研究結(jié)果表明血尿清膠囊能夠降低血尿和蛋白尿，而MMP-9、TIMP-1的異常表達(dá)參與了IgAN的發(fā)病機(jī)制，血尿清膠囊通過調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的平衡從而達(dá)到治療IgAN的目的。