PRP聯(lián)合金天格膠囊對人膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6及TNF-α水平的影響

吳克亮 肖慶華 張震 曾建春 馮文俊 曾意榮 林曉生

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；2深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種多因素導(dǎo)致的以膝軟骨退變及繼發(fā)性軟骨下骨質(zhì)增生硬化為病理特征的退行性骨關(guān)節(jié)病，常以膝痛、關(guān)節(jié)活動障礙為主癥〔1〕。據(jù)統(tǒng)計〔2〕，我國>60歲人群中，35%～50%有KOA癥狀。有研究表明，膝關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平與KOA的病程密切相關(guān)〔3～5〕。富血小板血漿(PRP)是由全血經(jīng)過數(shù)次離心后所得的血小板濃縮漿，富含生長因子，能減輕膝關(guān)節(jié)腔炎癥反應(yīng)并參與組織修復(fù)，現(xiàn)已廣泛運用于骨關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、半月板及軟骨損傷等領(lǐng)域〔6～8〕。中醫(yī)學(xué)將KOA歸于“痹癥”的范疇，中醫(yī)藥在防治KOA中發(fā)揮著重要作用〔9～11〕。金天格膠囊是參照天然虎骨的特征圖譜研發(fā)的新一代虎骨替代品制劑，具有抗炎、追風(fēng)鎮(zhèn)痛、健骨、抗骨質(zhì)疏松等作用〔12～15〕。

本研究采用PRP聯(lián)合口服金天格膠囊治療KOA，獲得了滿意的效果。為進一步探究其作用機制和臨床療效，本研究總結(jié)了PRP聯(lián)合口服金天格膠囊對膝關(guān)節(jié)疼痛及功能評分的療效，并對關(guān)節(jié)液中白細胞介素(IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α水平的影響，為臨床防治KOA提供一定的指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1研究對象及分組 選取2018年6月至2019年5月于深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院就診的70例KOA患者作為研究對象。以患者就診順序編號，隨機分為治療組和對照組，每組各35例。收集患者的性別、年齡、病程、體重指數(shù)(BMI)及患膝Kellgren-Lawrence分級的情況?；颊呔炇鹬橥鈺?，本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準實行。本研究隨訪期間共有6例脫落，最終納入治療組33例，對照組31例。兩組性別、年齡、病程、BMI及患膝Kellgren-Lawrence分級一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組基線資料比較

1.2診斷標準 根據(jù)《骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007版)》〔16〕：①1個月內(nèi)多次出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)疼痛；②X片(負重位)提示膝關(guān)節(jié)周圍骨贅形成，關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下硬化和(或)囊性變；③膝關(guān)節(jié)液實驗室檢查符合KOA；④年齡>40歲；⑤晨僵<30 min；⑥可捫及膝關(guān)節(jié)骨摩擦音；至少滿足①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥項，即KOA診斷成立。

1.3納入標準 ①符合上述診斷標準，為原發(fā)性單側(cè)KOA患者，Kellgren-Lawrence分級Ⅰ～Ⅲ級；②年齡45～70歲，且BMI<30 kg/m2；③近3個月內(nèi)未接受治療者；④膝周皮膚完整，無感染，能耐受關(guān)節(jié)穿刺者；⑤依從性好，能配合定期隨訪者。

1.4排除標準 ①膝周韌帶功能不全、膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)者；②存在嚴重內(nèi)科疾??；③存在全身骨代謝性疾病或有精神障礙者；④存在發(fā)熱、寒戰(zhàn)等全身癥狀或患膝局部熱紅腫等；⑤血小板計數(shù)低于15×109/L者。

1.5治療方法

1.5.1PRP制備 采集自體肘靜脈血約30 ml，裝入無菌含枸櫞酸鈉抗凝劑的注射器中，輕搖勻后取1 ml行血小板及白細胞計數(shù)檢測，2 000 r/min離心10 min，分離紅細胞；再次以3 500 r/min離心10 min，分離離心管底部的白膜樣血小板濃縮液，即得到PRP。通常情況下，每30 ml全血可獲得4～5 ml PRP，隨即進行膝關(guān)節(jié)腔注射。

1.5.2關(guān)節(jié)腔穿刺及治療 關(guān)節(jié)腔穿刺及藥物注射均由同一名骨科醫(yī)師操作。患者仰臥位，略屈曲膝關(guān)節(jié)，取膝關(guān)節(jié)外上穿刺點，術(shù)前常規(guī)消毒鋪巾；與關(guān)節(jié)線呈45°夾角穿刺進入髕骨與股骨間隙，回抽無血后，抽取適量關(guān)節(jié)液用于檢測，注入藥物。治療組每次注射4～5 ml PRP，2 w/次，共3次，并配合口服金天格膠囊(金花集團西安金花制藥廠，國藥準字Z20030080，0.4 g/粒)，3粒/次，3次/d。對照組每次注射玻璃酸鈉注射液(日本生化學(xué)工業(yè)株式會社高萩工廠，進口藥品注冊號H20140533，2.5 ml/支)，2 w/次，共3次。

所有患者行關(guān)節(jié)穿刺后留察15 min，且治療期間均不予口服非甾體鎮(zhèn)痛藥，暫不行針灸推拿、超聲、沖擊波等理療，指導(dǎo)患者適度鍛煉股四頭肌，避免久站久立及劇烈運動。

1.6療效評價

1.6.1觀察指標及療效 采用視覺模擬評分(VAS)、國際膝關(guān)節(jié)文獻委員會(IKDC)膝關(guān)節(jié)評分及美國西部Ontario和McMaster大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)(WOMAC)評分評估膝關(guān)節(jié)疼痛及功能。分別于治療前和治療8 w后評定。依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(2002版)》〔17〕分析臨床療效：①治愈，癥狀消失，關(guān)節(jié)活動正常，膝關(guān)節(jié)功能評分(KFS)減少≥95%；②顯效，癥狀消失，關(guān)節(jié)活動不受限，KFS減少≥70%且<95%；③有效，癥狀基本消除，關(guān)節(jié)活動輕度受限，KFS減少≥30%且<70%；④無效，癥狀與關(guān)節(jié)活動無明顯改善，KFS減少<30%?？傆行?(治愈+顯效+有效)/總例數(shù)×100%。

1.6.2檢測指標 所有患者于治療前及治療8 w后抽取患側(cè)膝關(guān)節(jié)液用于檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6及TNF-α的水平。購買IL-1β、IL-6及TNF-α試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司，產(chǎn)品編號分別為kt98060、kt34251、kt98069)，嚴格按照使用說明書操作。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、秩和檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1膝關(guān)節(jié)評分比較 與治療前相比，兩組治療后VAS評分及WOMAC評分均顯著降低，IKDC評分明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組治療后VAS評分顯著低于對照組(P<0.05)，但WOMAC及IKDC評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組治療前后VAS、WOMAC及IKDC膝關(guān)節(jié)評分比較分)

2.2療效比較 治療組總有效率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.3關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較 治療后兩組IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明顯下降(P<0.05)；組間比較，治療組關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6及TNF-α水平較對照組下降明顯(P<0.05)。見表4。

表3 兩組療效比較(n)

表4 兩組膝關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較

2.4不良反應(yīng) 治療組有1例在首次行PRP后出現(xiàn)輕度發(fā)熱，休息2 h后熱退；1例患膝灼痛，予冰敷，1 d后癥狀消失；對照組3例治療后患膝脹痛，2 d后緩解。兩組均無關(guān)節(jié)感染等不良事件。

3 討 論

KOA是中老年患者的常見病，病因復(fù)雜，目前仍是難治性疾病之一〔9〕。KOA病機主要以膝軟骨退化為核心，膝周組織呈慢性無菌性炎癥狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，KOA膝關(guān)節(jié)滑膜中存在大量巨噬細胞、中性粒細胞，能分泌大量致炎因子，影響KOA病程〔1,3,5,18〕。其中，IL和TNF是影響軟骨細胞功能的重要炎癥因子，IL-1β、IL-6及TNF-α是參與KOA進程的重要炎性介質(zhì)。分解代謝因子IL-1β和TNF-α參與軟骨細胞外基質(zhì)降解，并抑制軟骨細胞內(nèi)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成，干擾軟骨細胞的代謝，并誘導(dǎo)其凋亡〔19〕；IL-6是由單核吞噬細胞等在IL-1、TNF-α等誘導(dǎo)下產(chǎn)生的一種細胞因子，可加快基質(zhì)、纖維細胞降解，進而對膝關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生破壞作用〔20〕。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6及TNF-α水平與KOA病變程度呈正相關(guān)〔1,18,21〕。

PRP由全血經(jīng)梯度離心所得，能釋放多種生長因子、細胞因子，具有促進組織再生修復(fù)、調(diào)控炎癥反應(yīng)的性能，能夠促進損傷的軟骨修復(fù)，近年在治療KOA中獲得滿意的療效〔22～24〕。金天格膠囊系國家中藥一類新藥，主要成分為人工虎骨粉，具有健骨強筋、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛的功效〔25〕。其原料為動物骨骼，富含鈣質(zhì)、骨形態(tài)蛋白、膠原及各種骨生長因子等骨形成基質(zhì)?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)〔26,27〕，金天格膠囊具有活化并刺激軟細胞增殖，增加關(guān)節(jié)軟骨中膠原纖維的含量的作用；同時，提高骨質(zhì)鈣鹽沉積，改善骨密度，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。

本研究提示，PRP聯(lián)合金天格膠囊能有效降低膝關(guān)節(jié)液中相關(guān)炎性因子水平，改善膝關(guān)節(jié)疼痛及關(guān)節(jié)功能。其主要機制可能與PRP含有大量血小板源性生長因子和轉(zhuǎn)移生長因子有關(guān)，一方面能促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化軟骨細胞，增加合成軟骨基質(zhì)；另一方面，PRP有助于維持關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，減少滑膜增生并抑制炎性因子水平，減少軟骨分解代謝〔28〕。梁津喜等〔29〕發(fā)現(xiàn)PRP對KOA患者關(guān)節(jié)液成骨分化因子〔堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)及骨保護素/核因子-κB受體活化因子配體(OPG/RANKL)〕具有促進作用，從軟骨早期分化、分化和功能成熟3方面證實了PRP對軟骨細胞的修復(fù)作用。徐建軍等〔30〕對KOA兔模型行PRP，發(fā)現(xiàn)膝軟骨總體評分及微形態(tài)評分均優(yōu)于生理鹽水對照組(P<0.05)，認為PRP對受損軟骨具有一定的保護作用。此外，金天格膠囊中的生物來源骨膠原蛋白多肽是緩解KOA的有效成分〔25〕。研究表明〔12,15,31〕，金天格膠囊對治療KOA能有效緩解骨性關(guān)節(jié)炎造成的膝關(guān)節(jié)疼痛，可能與其改善骨質(zhì)及保護軟骨有關(guān)。

關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉已經(jīng)被廣泛用于治療KOA，且很多研究已經(jīng)證實其療效〔32,33〕。正如本研究中，患者行玻璃酸鈉治療后，KOA患者疼痛及膝關(guān)節(jié)功能評分均有所改善，與前期研究一致〔32〕。但可能因隨訪時間較短，兩組患者膝關(guān)節(jié)各項評分并無統(tǒng)計學(xué)差異。筆者認為，玻璃酸鈉結(jié)構(gòu)為高分子多糖，能潤滑膝關(guān)節(jié)軟骨及緩沖關(guān)節(jié)應(yīng)力，并阻止炎性介質(zhì)擴散，屏蔽疼痛感受器，在一定時期內(nèi)能緩解疼痛及增加關(guān)節(jié)功能；但相對于PRP，玻璃酸鈉對膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥因子抑制能力存在局限性。

綜上，PRP聯(lián)合金天格膠囊對KOA臨床療效確切，其機制可能與PRP抑制了膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6及TNF-α炎癥因子水平，并聯(lián)合金天格膠囊改善骨質(zhì)、促進軟骨修復(fù)有關(guān)。該治療方法通過抑制局部炎癥反應(yīng)，改善膝軟骨內(nèi)環(huán)境，從而達到緩解疼痛，改善膝關(guān)節(jié)功能的效果。下一步仍需要多中心、大樣本、遠期隨訪的前瞻性隨機對照研究進一步驗證結(jié)論的可靠性。值得一提的是，目前臨床上PRP治療方案、制備工藝及濃度梯度參差不齊，如何有效規(guī)范統(tǒng)一及進一步探究金天格膠囊具體有效成分及作用靶點，仍是今后研究的方向。