NrF2/Keap1/ARE信號(hào)通路在老年性青光眼患者小梁網(wǎng)組織功能損傷中的作用

王曉莉 張鍵 王友 李艷 龔雪 唐靜

(1簡(jiǎn)陽(yáng)市人民醫(yī)院眼科，四川 簡(jiǎn)陽(yáng) 641400；2四川大學(xué)華西醫(yī)院眼科)

老年性青光眼是一種視功能障礙性疾病，以眼壓升高所致的視乳頭低灌注為主要病理特征，臨床表現(xiàn)為視功能受損、視神經(jīng)受壓等癥狀，小梁組織變異在其中發(fā)揮重要作用〔1〕。房水主要經(jīng)小梁網(wǎng)流出，但小梁組織功能異常時(shí)會(huì)阻礙房水正常流出，使眼壓升高〔2〕。近年來研究顯示，氧化應(yīng)激和線粒體功能受損是小梁網(wǎng)細(xì)胞功能異常的主要原因之一，但具體分子機(jī)制仍未闡明〔3〕。E2 相關(guān)因子(NrF)2是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種抗氧化物質(zhì)活性水平的主要因子，能夠維持細(xì)胞的氧化-抗氧化平衡〔4〕。NrF2/ Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap)1/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)作為抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路已得到廣泛認(rèn)可，與多種眼科疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)〔5〕。本研究旨在探討NrF2/Keap1/ARE信號(hào)通路在老年性青光眼患者小梁網(wǎng)組織功能損傷中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2018年5月至2019年10月在簡(jiǎn)陽(yáng)市人民醫(yī)院確診為老年性青光眼患者42例(42眼)為老年性青光眼組。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合中國(guó)原發(fā)性青光眼診治專家共識(shí)中對(duì)老年性青光眼的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②視力、色覺等視功能障礙，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①虹膜炎、睫狀體炎等眼病所致的眼壓升高；②有眼部手術(shù)史或臨床資料不完整者。其中男24例，女18例；年齡62～81歲，平均(71.53±5.28)歲。另以因故死亡成人的供體眼球標(biāo)本35例為對(duì)照組。其中男21例，女14例；年齡57～76歲，平均(69.95±4.75)歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本與主要試劑 老年性青光眼患者均行小梁切除術(shù)，將術(shù)中切除的小梁網(wǎng)組織標(biāo)本分為兩部分，一分部液氮處理后-80℃保存；另一部分使用多聚甲醛固定后4℃冷藏保存。對(duì)照組切取小梁組織，標(biāo)本處理方法同老年性青光眼組。免疫組化檢測(cè)試劑盒、Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)于廣州國(guó)奧生物有限公司；全蛋白提取試劑盒購(gòu)于上海百研生物有限公司；兔抗人NrF2、ARE多克隆抗體、鼠抗人Keap1單克隆抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG均購(gòu)于江蘇恩莫阿賽生物有限公司；過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于山東蘇柯漢生物工程有限公司。

1.3免疫組化染色 取多聚甲醛固定的小梁網(wǎng)組織，石蠟包埋后連續(xù)切片，厚度4 μm，加入二甲苯和乙醇溶液，脫蠟至水，修復(fù)液中高壓修復(fù)抗原，室溫冷卻后磷酸鹽緩沖液沖洗。3%H2O2孵育15 min，分別加入一抗(1∶500稀釋)，37℃孵育2 h，磷酸鹽緩沖液沖洗，加入二抗，室溫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。梯度乙醇溶液逐級(jí)脫水，透明，中性樹脂封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，陽(yáng)性染色呈棕黃色，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)NrF2、Keap1、ARE陽(yáng)性表達(dá)率。

1.4RT-PCR檢測(cè) 取-80℃保存的小梁網(wǎng)組織標(biāo)本，Trizol法提取總RNA，測(cè)定純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。NrF2、Keap1、ARE及內(nèi)參GAPDH引物由上海百研生物有限公司設(shè)計(jì)合成，NrF2引物序列：上游5'-GGGATATCACTCAGCATAAT-3'，下游5'-GGCGACTCGTTATTGATCGT-3'；Keap1引物序列：上游5'-CAATACTACAGCGTCGAAAATCT-3'，下游5'-GAGGTGGCATGTGCGGATGCTAT-3'；ARE引物序列：上游5'-TGACTAGTATTAGTCGGTAT-3'，下游5'-GTAGAGGTGAGTCGTCCGACC-3'；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5'-GCAATGCGATTGATCCCGTAC-3'，下游5'-CAGCACTGACCCTTTGGTACT-3'。反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 50 s，50～65℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)，延伸72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計(jì)算NrF2、Keap1、ARE mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western印跡檢測(cè) 取-80℃保存的小梁網(wǎng)組織標(biāo)本，全蛋白提取試劑盒提取標(biāo)本組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。取目標(biāo)蛋白加入適量緩沖液，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后分別滴加兔抗人NrF2多克隆抗體(1∶500)、ARE多克隆抗體(1∶300)，鼠抗人Keap1單克隆抗體(1∶500)、GAPDH多克隆抗體(1∶1 000)，4℃冷藏過夜，次日滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG，山羊抗鼠IgG，均為1∶2 000稀釋，室溫孵育2 h，電化學(xué)(ECL)顯色，暗室中顯影、采集圖像，分析各條帶灰度值。

1.6小梁網(wǎng)組織中過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平檢測(cè) 取-80℃保存的小梁網(wǎng)組織標(biāo)本，組織勻漿，4℃ 12 000 r/min恒溫離心10 min，收集上清液，比色法檢測(cè)過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平，檢測(cè)過程嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化檢測(cè)小梁網(wǎng)組織中NrF2、Keap1、ARE表達(dá)情況 免疫組化染色顯示，Keap1在老年性青光眼患者小梁網(wǎng)組織中存在大量陽(yáng)性表達(dá)，而NrF2、ARE陽(yáng)性表達(dá)不明顯。NrF2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，Keap1、ARE主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。老年性青光眼組NrF2、ARE陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組，Keap1陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見圖1，表1。

圖1 免疫組化檢兩組測(cè)兩組小梁網(wǎng)組織中NrF2、Keap1、ARE表達(dá)(SP法，×200)

表1 兩組小梁網(wǎng)組織中NrF2、Keap1、ARE陽(yáng)性表達(dá)率比較

2.2兩組小梁網(wǎng)組織中NrF2、Keap1、ARE mRNA和蛋白表達(dá)比較 老年性青光眼組小梁網(wǎng)組織中NrF2、ARE mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組，Keap1 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；老年性青光眼組小梁網(wǎng)組織中NrF2、ARE蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，Keap1蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見表2，圖2。

表2 兩組NrF2、Keap1、ARE mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 小梁網(wǎng)組織中NrF2、Keap1、ARE蛋白Western印跡電泳

2.3兩組小梁網(wǎng)組織中過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平比較 老年性青光眼組小梁網(wǎng)組織中過氧化物酶水平顯著高于對(duì)照組，超氧化物歧化酶水平顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見表3。

表3 兩組小梁網(wǎng)組織中過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平比較

2.4老年性青光眼組小梁網(wǎng)組織中NrF2、Keap1、ARE表達(dá)與過氧化物酶和超氧化物歧化酶的相關(guān)性 NrF2、ARE與過氧化物酶水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.718、-0.763，P=0.003、0.000)，與超氧化物歧化酶水平呈正相關(guān)(r=0.750、0.795，均P=0.000)。Keap1與過氧化物酶水平呈正相關(guān)(r=0.811，P=0.000)，與超氧化物歧化酶水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.849，P=0.000)。

3 討 論

老年性青光眼以視野障礙和視盤受損為主要特征。相關(guān)研究顯示，眼壓≥20 mmHg患者老年性青光眼的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)約為眼壓<20 mmHg患者的16倍，提示高眼壓是老年性青光眼的主要病理因素〔6〕。小梁網(wǎng)位于前房角的角鞏膜邊緣區(qū)域，呈三角形，能夠調(diào)節(jié)房水流出〔7〕；研究者在小梁網(wǎng)胞外基質(zhì)中觀察到了大量基因突變，硬度增加，提示小梁網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞增加、組織硬化等是老年性青光眼患者眼壓升高的主要原因，眼壓升高會(huì)進(jìn)一步壓縮小梁網(wǎng)，造成細(xì)胞外基質(zhì)沉積，房水流出阻力增加〔8〕。因此，探討小梁網(wǎng)組織病變的相關(guān)機(jī)制對(duì)提升老年性青光眼的降眼壓治療效果具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子NrF2在亮氨酸調(diào)節(jié)蛋白家族成員中活性最強(qiáng)，廣泛表達(dá)于人體各器官和組織細(xì)胞中〔9〕。NrF2包括NeH1～6個(gè)不同的功能區(qū)域，其中NeH1為含C末端的結(jié)構(gòu)域，參與NrF2識(shí)別并結(jié)合抗氧化活性因子ARE；NeH2與Keap1結(jié)合后能夠抑制NrF2活化，使NrF2處于失活狀態(tài)；NeH3是NrF2的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，與重組蛋白結(jié)合后能夠上調(diào)NrF2靶基因的表達(dá)；NeH4和NeH5同時(shí)與輔助因子CBP結(jié)合后，能夠啟動(dòng)NrF2下游基因轉(zhuǎn)錄；NeH6是氧化還原反應(yīng)的不敏感區(qū)，能夠降解氧化激活的NrF2〔10，11〕。綜合上述各功能區(qū)域的作用，NrF2高表達(dá)能夠促進(jìn)機(jī)體的抗氧化作用，降低機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Keap1是NrF2的多區(qū)域抑制蛋白，由CTR、NTR、DGR在內(nèi)的5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成〔12〕。Keap1能夠通過DGR區(qū)域與NrF2特異性結(jié)合，分布于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上，抑制NrF2進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而抑制其活性〔13〕。同時(shí)CTR、NTR能夠參與泛素連接酶的合成，參與NrF2降解，與NrF2穩(wěn)定性有關(guān)〔14〕。因此，Keap1表達(dá)上調(diào)會(huì)降低NrF2活性和穩(wěn)定性，增強(qiáng)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)?？寡趸磻?yīng)元件ARE是人體重要的保護(hù)性應(yīng)答元件，序列位于編碼保護(hù)蛋白基因上游的啟動(dòng)子區(qū)，激活后可上調(diào)NADH氧化還原酶復(fù)合物、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等多種保護(hù)性基因的表達(dá)〔15〕。

本研究結(jié)果提示老年性青光眼患者小梁網(wǎng)組織中NrF2、ARE低表達(dá)，Keap1高表達(dá)。目前關(guān)于NrF2/Keap1/ARE信號(hào)通路激活機(jī)制的研究顯示，NrF2介導(dǎo)細(xì)胞防御的開啟和關(guān)閉主要與Keap1的負(fù)性調(diào)節(jié)有關(guān)〔16〕。人體正常狀態(tài)下，NrF2主要分布于細(xì)胞質(zhì)，與抑制蛋白Keap1處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持機(jī)體的氧化應(yīng)激平衡〔17〕。當(dāng)受到抗氧化劑或親電子物質(zhì)作用時(shí)，Keap1上的氨基酸殘基被修飾，構(gòu)象發(fā)生改變，與NrF2的耦聯(lián)作用減弱，NrF2活性增強(qiáng)，Keap1與NrF2之間的平衡狀態(tài)被打破，機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)減弱〔18〕。同時(shí)NrF2還存在另一種磷酸化激活方式，當(dāng)NrF2被磷酸化激活后會(huì)出現(xiàn)核內(nèi)轉(zhuǎn)位，通過植物堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)與小Maf家族蛋白特異性結(jié)合形成活化ARE，減弱機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)〔19〕。

線粒體分泌的活性氧是人體氧化應(yīng)激的主要促進(jìn)因素，促氧化標(biāo)志物過氧化物酶和抗氧化標(biāo)志物超氧化物歧化酶可從多個(gè)途徑損傷小梁網(wǎng)細(xì)胞DNA，導(dǎo)致小梁網(wǎng)細(xì)胞死亡〔20〕。本研究結(jié)果提示NrF2、ARE高表達(dá)能夠有效降低老年性青光眼患者小梁網(wǎng)組織中的促氧化活性物質(zhì)分泌水平，提升抗氧化活性物質(zhì)的分泌水平，抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而降低眼壓，實(shí)現(xiàn)控制和改善臨床癥狀的目的。

綜上，老年性青光眼患者小梁網(wǎng)組織中NrF2、ARE低表達(dá)，Keap1高表達(dá)，與氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。通過激活NrF2/Keap1/ARE信號(hào)通路可能改善小梁網(wǎng)組織線粒體功能，抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)，降低眼內(nèi)壓，控制患者的臨床癥狀。