基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討益腎降濁湯對(duì)環(huán)孢素A腎毒性的作用及機(jī)制※

●鄭登勇 阮杏林 王建挺 丘余良 阮詩瑋▲

環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）目前廣泛用于治療實(shí)體器官移植及自身免疫性疾病，顯著延長了移植器官的存活時(shí)間和患者的生命，但CsA的急慢性腎毒性制約其臨床應(yīng)用[1]。急性腎毒性與CsA損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致腎血管收縮，腎臟血流灌注不足，腎小球?yàn)V過率下降有關(guān)；慢性腎毒性與CsA上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，引起腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、腎間質(zhì)纖維化有關(guān)[2]。目前尚無肯定的可應(yīng)用于臨床的減輕CsA腎毒性的藥物[3]。

中醫(yī)認(rèn)為，環(huán)孢素A 腎損傷系藥毒傷腎，導(dǎo)致脾腎虧虛為本，濕濁血瘀為標(biāo)[1,4]。益腎降濁湯系福建省名中醫(yī)阮詩瑋教授治療慢性腎功能衰竭的經(jīng)驗(yàn)方，臨床已使用30 余年，療效良好。益腎降濁湯“益腎健脾、降濁化瘀”之功效契合環(huán)孢素A腎損傷的病機(jī)，故課題檢測益腎降濁湯對(duì)環(huán)孢素A誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷細(xì)胞活力的影響。鑒于中藥復(fù)方成分復(fù)雜以及作用的多靶點(diǎn)，機(jī)制研究采用轉(zhuǎn)錄組測序(transcriptome sequencing，RNA-seq)技術(shù)分析益腎降濁湯治療CsA 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞損傷的差異表達(dá)基因，探討益腎降濁湯減輕CsA腎毒性的可能靶點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞HK-2 細(xì)胞株（購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。

1.2 益腎降濁湯益腎降濁湯由太子參15 g、生黃芪30 g、生白術(shù)15 g、茯苓15 g、槲寄生15 g、懷牛膝15 g、桑椹15 g、丹參30 g、當(dāng)歸10 g、大黃9 g、六月雪15 g、車前子15 g、陳皮10 g 組成，所有中藥飲片購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院中藥房。濃煎為1.0 g/mL。YSJZT 用0.22 μm 無菌濾器過濾,分裝放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及儀器環(huán)孢素軟膠囊(新山地明，批準(zhǔn)文號(hào)J20140116，諾華制藥)。Cell Count Kit-8（CCK-8）試劑（Cat:M4839-500Tests，Abmole BioScience）。胎牛血清（gibco 10099-141C）；DME/F12 Medium（hyclone SH30023.01B）；青霉素-鏈霉素（雙抗）（100X）（hyclone SV30010）；TRYPSIN 0.25%（1X）Solution（hyclone SH30042.01）；TRIzol(上海生工B511311)。熒光相差倒置顯微鏡（NIKON ? ECLIPSE Ts2R-FL）；二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO MCO-15AC)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HK-2細(xì)胞株在DME/F12培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%雙抗）中培養(yǎng)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 益腎降濁湯對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響取對(duì)數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板中（100 μl/孔），每組5 個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后更換培養(yǎng)液。給予各濃度益腎降濁湯的培養(yǎng)液（0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL），同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照和空白對(duì)照組（僅有培養(yǎng)基無細(xì)胞），置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h。各組干預(yù)完成后，每孔分別加入10 μlCCK-8試劑，孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度值（OD值）。根據(jù)所測OD 值計(jì)算細(xì)胞活力（%）=（YSJZT 組-空白對(duì)照組）/（正常對(duì)照組-空白對(duì)照組）×100%。

2.3 CsA 對(duì)HK-2 細(xì)胞活力的影響取對(duì)數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板中（100 μl/孔），每組5 個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液。用環(huán)孢素A 軟膠囊CsA 原液直接稀釋在培養(yǎng)基，給予各濃度的CsA 培養(yǎng)液（4.2 μmol/L、8.4 μmol/L、12.6 μmol/L、16.8 μmol/L、21 μmol/L、42 μmol/L），同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照和空白對(duì)照組（僅有培養(yǎng)基無細(xì)胞），置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h。各組干預(yù)完成后，每孔分別加入10 μlCCK-8 試劑，孵育2 h 后酶標(biāo)儀檢測450 nm 處OD值。根據(jù)所測OD值計(jì)算細(xì)胞活力（%）=（CsA組-空白對(duì)照組）/（正常對(duì)照組-空白對(duì)照組）×100%。

2.4 益腎降濁湯對(duì)環(huán)孢素A誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷細(xì)胞活力的影響取對(duì)數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板中（100 μl/孔），每組5 個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后更換培養(yǎng)液。根據(jù)CCK-8檢測各濃度YSJZT和CsA影響HK-2細(xì)胞活力的結(jié)果,選擇合理的CsA 濃度誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞損傷模型，孵育24 h后更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h。并選擇合理的YSJZT濃度干預(yù)CsA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型48 h。同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照和空白對(duì)照組（僅有培養(yǎng)基無細(xì)胞）。各組干預(yù)完成后，每孔分別加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值。根據(jù)所測OD值計(jì)算細(xì)胞活力（%）=（CsA組或者YSJZT組-空白對(duì)照組）/（正常對(duì)照組-空白對(duì)照組）×100%。

2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變選擇對(duì)數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞按105個(gè)/孔種入6孔板（2 mL/孔）。分3組：正常對(duì)照組（NC 組）、模型組（C 組，CsA 16.8 μmol/L）和治療組（T組，YSJZT 0.5 mg/mL+CsA 16.8 μmol/L），藥物濃度根據(jù)“2.3”和“2.4”CCK8 檢測結(jié)果選擇，干預(yù)措施同“2.4”。各組干預(yù)完成后，相差顯微鏡下（200×）觀察各組細(xì)胞形態(tài)改變。

2.6 轉(zhuǎn)錄組測序選擇對(duì)數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞按105個(gè)/孔種入6 孔板（2 mL/孔）。分為NC 組、C 組（CsA 16.8 μmol/L）和T 組（YSJZT 0.5 mg/mL+CsA 16.8 μmol/L），YSJZT對(duì)CsA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型干預(yù)措施同“2.4”。各組干預(yù)完成后，采用Trizol 法提取HK-2 細(xì)胞總RNA，Agilent 2100 進(jìn)行RNA 定量及質(zhì)檢。構(gòu)建單鏈環(huán)狀DNA 文庫，文庫質(zhì)檢合格后通過DNBSEQ 測序平臺(tái)進(jìn)行測序。由深圳華大基因股份有限公司完成。

2.7 差異表達(dá)基因篩選及交集DEG 功能富集分析采用DESeq進(jìn)行比對(duì)組間顯著差異基因分析，篩選比對(duì)組間差異表達(dá)基因，顯著差異表達(dá)基因篩選條件為：|log2（fold change）|≥1；且Qvalue＜0.05。利用基因本體（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫，對(duì)交集的DEG進(jìn)行GO功能與信號(hào)通路富集分析，以校正P＜0.05為顯著性閾值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用One-Way ANOVA 分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 益腎降濁湯對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響各濃度YSJZT 處理48 h 后，0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL 對(duì)HK-2 細(xì)胞活力無明顯抑制，各組細(xì)胞活力分別為（103.20±1.98）%、（99.15±2.19）%、（97.42±3.58）%；1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL對(duì)HK-2細(xì)胞活力有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的抑制作用，各組細(xì)胞活力分別為（91.07±4.59）%、（89.45±1.70）%、（92.49±1.99）%。結(jié)果見圖1a。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇YSJZT 0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL 三個(gè)濃度。

3.2 CsA 對(duì)HK-2 細(xì)胞活力的影響經(jīng)過各濃度CsA處理24 h后，撤掉CsA繼續(xù)培養(yǎng)24 h，4.2 μmol/L、8.4 μmol/L 對(duì)HK-2 細(xì)胞活力無抑制，各組細(xì)胞活力分別為（96.96±4.52）%、（88.36±6.24）%；12.6 μmol/L、16.8 μmol/L、21 μmol/L、42 μmol/L 對(duì)HK-2 細(xì)胞活力均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的抑制，各組細(xì)胞活力分別為（84.18±7.36）%、（81.34±9.47）%、（28.68±13.97）%、（0.33±0.21）%。結(jié)果見圖1b。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇CsA 16.8 μmol/L誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型。

3.3 益腎降濁湯對(duì)CsA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷細(xì)胞活力的影響與NC 組比較，CsA 16.8 μmol/L 模型組HK-2 細(xì)胞活力顯著降低，其細(xì)胞活力為（76.48±3.16）%；與模型組比較，YSJZT 0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL治療后HK-2細(xì)胞活力明顯提升，各組的細(xì)胞活力分別為（86.59±10.10）%、（87.64±5.91）%、（89.70±5.15）%。結(jié)果見圖1c。根據(jù)不同濃度YSJZT對(duì)CsA 誘導(dǎo)HK-2 損傷細(xì)胞活力的恢復(fù)情況，故課題后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇YSJZT 0.5 mg/mL對(duì)模型進(jìn)行干預(yù)。

3.4 益腎降濁湯對(duì)CsA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷形態(tài)的影響NC 組細(xì)胞形態(tài)正常；C 組為CsA 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞損傷模型組，相差顯微鏡下HK-2 細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量大小不等的空泡及部分鈣化點(diǎn)；T 組為益腎降濁湯治療組，HK-2細(xì)胞內(nèi)空泡及鈣化改善不明顯。見圖2。

圖1 益腎降濁湯對(duì)CsA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷細(xì)胞活力的影響

圖2 相差顯微鏡下觀察益腎降濁湯對(duì)環(huán)孢素A誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷形態(tài)的影響（200×）

3.5 各比對(duì)組間差異表達(dá)基因情況RNA-seq測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C 組與NC 組比對(duì)得到顯著差異表達(dá)基因1410個(gè)（其中上調(diào)基因812個(gè)、下調(diào)基因598個(gè)），見圖3a 和圖3b。T 組與C 組比對(duì)得到顯著差異表達(dá)基因127 個(gè)（其中上調(diào)基因71 個(gè)、下調(diào)基因56 個(gè)），見圖4a和圖4b。為明確YSJZT 減輕CsA 腎毒性的主要靶基因，將T 組比對(duì)C 組上調(diào)DEG 交集C 組比對(duì)NC 組下調(diào)DEG，得到36 個(gè)DEG；將T 組比對(duì)C 組下調(diào)DEG 交集C 組比對(duì)NC 組上調(diào)DEG，得到30 個(gè)DEG，見圖5a和圖5b。

圖3 模型組比對(duì)正常對(duì)照組差異表達(dá)基因柱狀圖及火山圖

圖4 益腎降濁湯治療組比對(duì)模型組差異表達(dá)基因柱狀圖及火山圖

圖5 不同比對(duì)組間交集基因韋恩圖

3.6 差異表達(dá)基因GO 功能富集分析交集得到的66 個(gè)DEG 進(jìn)行GO 功能富集分析,從細(xì)胞組分(cellular component)、生物過程(biological process)和分子功能(Molecular Function)三大功能類別中各選取富集最顯著的10個(gè)GO term繪制柱狀圖。通過GO功能富集分析可看出益腎降濁湯治療后顯著回調(diào)的差異基因功能主要集中在生物學(xué)過程中的雌激素代謝過程(estrogen metabolic process)、表皮生長因子受體信號(hào)通路（epidermal growth factor receptor signaling pathway,EGFR）、視黃醇代謝過程（retinol metabolic process）；分子功能中的雌激素酮磺基轉(zhuǎn)移酶活性（estrone sulfotransferase activity）、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體綁定(granulocyte macrophage colonystimulating factor receptor binding)；細(xì)胞組分中的主要變化在細(xì)胞外間隙(extracellular space)、質(zhì)膜的組成部分（integral component of plasma membrane）。見圖6。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，集落刺激因子2（Colony-Stimulating Factor 2,Csf 2）注釋到分子功能的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體綁定中；磺基轉(zhuǎn)移酶1E 家族成員1（sulfotransferase family 1E member 1，Sult1E1）注釋到分子功能的雌激素酮磺基轉(zhuǎn)移酶活性及生物學(xué)過程的雌激素代謝過程中；上皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin，EREG）注釋到生物學(xué)過程的EGFR信號(hào)通路中。

圖6 交集差異表達(dá)基因的GO富集分析三大功能類別柱狀圖

3.7 差異表達(dá)基因KEGG 通路富集分析差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析以P＜0.05為顯著性閾值，對(duì)交集基因進(jìn)行KEGG富集分析，以最顯著變化的11個(gè)通路繪制氣泡圖，其中涉及的信號(hào)通路包括：甾類激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）、細(xì)胞色素P450 代謝的生物異源物質(zhì)（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、藥物代謝-細(xì)胞色素P450（Drug metabolism-cytochrome P450）、視黃醇的代謝（Retinol metabolism）、ErbB 信號(hào)通路（ErbB signaling pathway）、FcεRI 信號(hào)通路（Fc epsilon RI signaling pathway）T 細(xì)胞受體信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway）等。見圖7。

圖7 交集差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析氣泡圖

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Csf 2注釋到Fc epsilon RI 信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路；Sult1E1 注釋到甾類激素生物合成通路；EREG注釋到ErbB信號(hào)通路。

4 討論

環(huán)孢素A 腎損傷屬于中醫(yī)學(xué)“關(guān)格”“腰痛”等范疇[1]。環(huán)孢素A 腎損傷系藥毒傷腎，導(dǎo)致“脾腎虧虛”尤其是“腎精虧虛”；脾腎失運(yùn)，導(dǎo)致濕濁內(nèi)停；毒損腎絡(luò)，瘀血內(nèi)阻。脾腎虧虛、濕濁血瘀是CsA 腎損傷的根本病機(jī)[1,4]。益腎降濁湯主要用于慢性腎功能衰竭“脾腎氣虛，濕濁血瘀”證。方中太子參、生黃芪、生白術(shù)、茯苓健脾益氣、利水滲濕；槲寄生、懷牛膝、桑椹益腎；丹參、當(dāng)歸、懷牛膝活血化瘀；大黃、六月雪、車前子通腑降濁解毒；陳皮健脾理氣、助運(yùn)降逆。諸藥共奏益腎健脾，降濁化瘀之功效。在前期的基礎(chǔ)研究中，益腎降濁湯[5]及其院內(nèi)制劑益腎降濁沖劑治療5/6腎切除慢性腎功能衰竭大鼠，均能改善大鼠腎功能和抑制腎小管間質(zhì)纖維化[6,7]。益腎降濁湯之功效契合CsA腎損傷的病機(jī)。

故課題檢測益腎降濁湯對(duì)環(huán)孢素A誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷細(xì)胞活力的影響。如圖1c所示，發(fā)現(xiàn)益腎降濁湯可回調(diào)環(huán)孢素A 引起的HK-2 細(xì)胞活性下降，因此益腎降濁湯是減輕環(huán)孢素腎毒性的有效藥物。但YSJZT 對(duì)環(huán)孢素A 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞損傷細(xì)胞內(nèi)空泡改善不明顯，可能與環(huán)孢素A撤藥后YSJZT繼續(xù)干預(yù)時(shí)間仍偏短有關(guān)。

RNA-seq測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組與NC組比對(duì)得到顯著差異表達(dá)基因1410 個(gè)（其中上調(diào)基因812 個(gè)、下調(diào)基因598個(gè)）；YSJZT治療組與模型組比對(duì)得到顯著差異表達(dá)基因127 個(gè)（其中上調(diào)基因71 個(gè)、下調(diào)基因56 個(gè)）。為明確YSJZT 減輕CsA 腎毒性的主要靶基因，將T 組比對(duì)C 組上調(diào)DEG 交集C 組比對(duì)NC 組下調(diào)DEG，得到36 個(gè)DEG；將T 組比對(duì)C 組下調(diào)DEG 交集C 組比對(duì)NC 組上調(diào)DEG，得到30 個(gè)DEG。對(duì)交集的66 個(gè)基因進(jìn)行GO 富集分析,可看出YSJZT 治療后顯著回調(diào)的差異基因功能主要集中在生物學(xué)過程中的雌激素代謝過程、表皮生長因子受體信號(hào)通路、視黃醇代謝過程，分子功能中的雌激素酮磺基轉(zhuǎn)移酶活性、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體綁定。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，涉及信號(hào)通路有甾類激素生物合成、ErbB 信號(hào)通路、FcεRIFc 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路等。提示益腎降濁湯減輕環(huán)孢素A 腎小管細(xì)胞毒性的作用機(jī)制比較廣泛。

Csf 2在GO功能分類分子功能中的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體綁定和KEGG pathway 富集的Fc epsilon RI 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路中發(fā)揮作用。腎損傷后巨噬細(xì)胞在腎內(nèi)積聚，并經(jīng)歷由促炎(M1)表型向正常修復(fù)所需的選擇性激活(M2)表型的轉(zhuǎn)變。在人M1 巨噬細(xì)胞與HK-2 細(xì)胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中Csf 2增加最多，Csf 2只由HK-2細(xì)胞分泌。重組人Csf 2 蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1 向M2 表型轉(zhuǎn)化。暴露于外源性Csf 2 后，M1 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞凋亡和活性氧釋放減弱。在盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥小鼠腹腔注射Csf 2 中和抗體會(huì)加重腎損傷，抑制腎小管增殖，進(jìn)而降低存活率。而重組小鼠Csf 2 蛋白可以挽救膿毒癥小鼠[8]。慢性環(huán)孢素A腎毒性患兒腎活檢組織病理發(fā)現(xiàn)間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤[8]，同時(shí)在慢性CsA腎毒性大鼠也發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤，與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A 干預(yù)HK-2細(xì)胞后Csf 2顯著下調(diào)[log2(C/NC)=-2.043]，益腎降濁湯治療后顯著回調(diào)[log2(T/C)=1.255]，提示益腎降濁湯上調(diào)Csf 2 是其減輕環(huán)孢素A 腎毒性的可能靶點(diǎn)之一。

Sult1E1 在GO 分類分子功能中的雌激素酮磺基轉(zhuǎn)移酶活性、生物學(xué)過程中的雌激素代謝過程和KEGG pathway 富集的甾類激素生物合成通路中發(fā)揮作用。研究表明雌激素可以減輕小鼠急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI),雌激素Sult1E1 通過磺化和失活雌激素在雌激素穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，在小鼠急性腎缺血再灌注損傷模型，Sult1E1 基因敲除或?qū)ζ渌幚硪种茰p輕了雌雄小鼠AKI，與性激素的存在無關(guān)。Sult1E1 在AKI 的發(fā)病機(jī)制中具有新的功能[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A干預(yù)HK-2細(xì)胞后Sult1E1顯著上調(diào)[log2(C/NC)=3.153]，益腎降濁湯治療后顯著回調(diào)[log2(T/C)=-1.177]，提示益腎降濁湯抑制Sult1E1可能是其減輕環(huán)孢素A腎毒性的作用機(jī)制之一。

EREG 在GO 分類生物學(xué)過程中的EGFR 信號(hào)通路和KEGG pathway 富集的ErbB 信號(hào)通路中發(fā)揮作用。Epiregulin 與表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）在促進(jìn)腎近端小管上皮細(xì)胞（renal proximal tubular cells，RPTC）增殖和遷移方面具有相當(dāng)?shù)淖饔?。表皮調(diào)節(jié)蛋白是RPTC的一種有效的有絲分裂原，可能通過激活EGFR 和PI3K/Akt 通路促進(jìn)腎臟再生[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A 干預(yù)HK-2 細(xì)胞后EREG顯著下調(diào)[log2(C/NC)=-3.689]，益腎降濁湯治療后顯著回調(diào)[log2(T/C)=1.653]，提示益腎降濁湯上調(diào)EREG 可能是其減輕環(huán)孢素A 腎毒性的作用機(jī)制之一。但在體內(nèi)過量的EGFR 和ErbB 信號(hào)激活是有害的[13]，故益腎降濁湯在體內(nèi)對(duì)EREG 的調(diào)控需要進(jìn)一步研究，以全面了解YSJZT對(duì)EREG的調(diào)控。

綜上，益腎降濁湯通過多靶點(diǎn)恢復(fù)環(huán)孢素A誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的細(xì)胞活力，其中調(diào)控Csf 2、Sult1E1、EREG 多個(gè)靶基因及其相關(guān)信號(hào)通路，可能是益腎降濁湯減輕環(huán)孢素A 腎毒性的作用機(jī)制。以上分析的可能靶基因仍需要體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。