白果內(nèi)酯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠TLR4/NFκB信號(hào)通路及Th1/Th2細(xì)胞的影響*

趙俊泉 暴玉振 韓承河

(1.濟(jì)南市人民醫(yī)院急診科，山東 濟(jì)南 271100;2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，山東 泰安 271000)

膿毒癥是以感染為主要病因的炎癥反應(yīng)綜合征，可誘發(fā)多器官功能障礙綜合征[1-3]。其中急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)最早出現(xiàn)，且會(huì)使病情加重，導(dǎo)致患者呼吸衰竭而死亡[4-5]。ALI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Toll樣受體-4(Toll like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路被激活，可使炎癥介質(zhì)大量釋放，進(jìn)而加重肺損傷[6]。輔助性T淋巴細(xì)胞1/2(Helper T lymphocyte 1/2，Th1/Th2)可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)促炎、抗炎反應(yīng)平衡情況[7]。白果內(nèi)酯(Bilobalide，BB)是從銀杏果仁中提取的唯一一種倍半萜物質(zhì)，具有抑制炎癥、減輕氧化應(yīng)激水平等作用[8-9]。但白果內(nèi)酯對(duì)膿毒癥所致ALI大鼠保護(hù)作用及對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路和Th1/Th2細(xì)胞的影響，還未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，本文探討白果內(nèi)酯(BB)對(duì)膿毒癥致ALI大鼠Toll樣受體-4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路及輔助性T細(xì)胞1/2(Th1/Th2)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)同遺傳背景的SD大鼠50 只，體重 200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵) 2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為省科委2000A027。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，噪音低于80分貝，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本研究經(jīng)北京動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，批號(hào)為IACUC-01(20160917)。

1.2 主要試劑及儀器 BB(貨號(hào)33570-04-6，南京春秋生物科技有限公司)；HE染色試劑盒(貨號(hào)E607218-0200，上海生工公司)；氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO) 、白細(xì)胞介素-6(Interleukin6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)等 ELISA試劑盒(貨號(hào)EK-0514，上海和序生物科技有限公司)；抗體TLR4、β-actin(貨號(hào)AP4016，AP1356美國(guó)Perkin Elmer公司)；蛋白提取試劑盒凝膠電泳遷移率轉(zhuǎn)變分析(EMSA)試劑盒(貨號(hào)：AP2032，美國(guó)pierce公司)；帶有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸DNA3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCGG-5′,5′-AGTTGA GGGGACTTTCCCAGGC-3′；貨號(hào)：2018032402，上海生工生物技術(shù)有限公司；混合刺激劑(含離子霉素1 mg/L，莫能菌素3 mg/L，貨號(hào)：S3234，Sigma公司)；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(貨號(hào)P0027、P0011，上海碧云天公司)等。手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(型號(hào)RM2125RTS，德國(guó)Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)SMZ745，日本尼康公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)XElx800，美國(guó)Perkin Elmer公司)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)1659001、Trans-Blot SD，美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(型號(hào)：GIS-500，MiuLab公司)等。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥 參照文獻(xiàn)[10]采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)(CLP)制備大鼠膿毒癥ALI模型，操作方法：取45只SD大鼠以30 mg/kg劑量的2.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)，清理腹部皮毛后，沿中線剪切3 vcm切口，打開(kāi)腹腔，顯露盲腸，用1～0絲線在距盲腸端1 cm處結(jié)扎，用針穿刺盲腸形成漏點(diǎn)，隨后將盲腸放回腹腔，逐層縫合切口并包扎，術(shù)后觀察1～6 h內(nèi)大鼠飲食、呼吸狀況，大鼠飲食減少，呼吸急促，眼、鼻處分泌物增多，并隨機(jī)取2只，取肺組織行染色，若肺組織出現(xiàn)肺間質(zhì)水腫及炎性浸潤(rùn)，表明造模成功，共造模成功40只大鼠(3只死亡)。結(jié)束后隨機(jī)分為ALI組、BB低劑量組(2.5 mg/kg)、BB高劑量組(10 mg/kg)、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組(0.45 mg/kg)，每組各10只，另取10只大鼠僅暴露盲腸后關(guān)腹，設(shè)為Sham組。各組大鼠CLP術(shù)后6h開(kāi)始給藥，BB低、高劑量藥物及地塞米松陽(yáng)性藥物參照文獻(xiàn)[11-12]分別以生理鹽水配置為0.250、0.100、0.045 mg/mL的混懸液，藥物處理組大鼠均以10 mL/kg的劑量經(jīng)尾靜脈注射3 d，每天3次，Sham組與ALI組均經(jīng)尾靜脈注射等劑量生理鹽水。

1.3.2 肺組織采集 末次給藥結(jié)束后1 h，將大鼠麻醉處死，然后解剖大鼠，剪開(kāi)大鼠腹部皮膚，暴露雙側(cè)肋膈角，在膈肌上剪一小口，使雙肺萎陷后，剪斷胸腔雙側(cè)肋骨及胸骨上緣，取出雙側(cè)肺組織，左側(cè)肺組織放入4%多聚甲醛中固定后，置于4 ℃冰箱中保存48 h以備HE 染色，右肺迅速置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 HE法檢測(cè)大鼠肺組織病理?yè)p傷 取出1.2.2中左肺，進(jìn)行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片后，用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木精-伊紅染色5 min，1%鹽酸酒精分化10 s，蒸餾水漂洗2 min, 梯度酒精脫水2 min，二甲苯透明處理，中性光學(xué)樹(shù)脂封片后，置于顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)大鼠肺組織MPO、IL-6、TNF-α含量 取1.2.2中右肺組織置于4℃冰箱中解凍后，剪碎，制備組織勻漿液，以ELISA試劑盒檢測(cè)其中MPO、IL-6、TNF-α水平，具體操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5 EMSA法檢測(cè)大鼠肺組織NF-κB活性 取1.2.2中右肺組織，于4 ℃冰箱中解凍后，嚴(yán)格按核蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取肺組織核蛋白；制備生物素標(biāo)記探針，用5′端生物素標(biāo)記帶有 NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸并將其作為探針，將核蛋白與探針在室溫下孵育20 min，然后以 6.5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)大鼠肺組織TLR4通路蛋白表達(dá) 取1.2.2中右肺組織，置于4 ℃冰箱中解凍后，用蛋白裂解液提取蛋白，參照BCA試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定其中蛋白濃度，然后調(diào)整蛋白濃度至相同，經(jīng)煮沸變性后，各取20 μL樣品液進(jìn)行電泳分離蛋白，將全部蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5%的脫脂奶粉溶液中，于搖床上室溫封閉2 h。將目的蛋白條帶根據(jù)分子量截取下來(lái)，置于孵育盒中，加入1∶2000的兔源TLR4、β-actin一抗，于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST漂洗3次，加入1∶1000的羊抗兔二抗溶液，于搖床上室溫孵育2 h，經(jīng)TBST再次漂洗3次，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3.7 FACS法檢測(cè)大鼠肺組織Th1/Th2細(xì)胞比值 取1.2.2中右肺組織，4 ℃冰箱中解凍后，剪碎，用胰蛋白酶處理消化，制備肺細(xì)胞懸液，取6×106個(gè)肺細(xì)胞與混合刺激劑混合后，在溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的條件下孵育24 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、離心后，分別取2×106個(gè)細(xì)胞加到標(biāo)記為對(duì)照、α-干擾素(IFN-α)、IL-4的試管中后，再分別依次加入PerCP-CD 85 μL、異硫氰酸熒光素(FITC-CD)32 μL，在室溫避光條件下孵育30 min，洗滌、離心后，加溶血?jiǎng)? mL離心、棄上清，再分別加入750 μL 4%多聚甲醛和750 μL含10%正常鼠血清的0.1%皂素750 μL，室溫避光離心，棄上清后，向?qū)φ展苤腥? μL熒光抗體同亞型抗體；向IFN-α管中加入20 μL IFN-α；向IL-4管中加入5μL IL-4。分別室溫避光30 min，0.1%皂素洗滌、離心后，棄上清，用500 μL PBS洗滌后，上機(jī)檢測(cè)。以SSC/CD3做點(diǎn)圖，取CD3陽(yáng)性的細(xì)胞群做門(Rl)，取RI內(nèi)的細(xì)胞以CDS/IFN-α和CDS/IL-4做點(diǎn)圖，讀取CDS/IFN-α細(xì)胞群百分?jǐn)?shù)為Th1細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，讀取CDS/IL-4細(xì)胞群百分?jǐn)?shù)為Th2細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，兩者比值即為Th1/Th2。

2 結(jié)果

2.1 白果內(nèi)酯對(duì)大鼠肺組織病理?yè)p傷的影響 Sham組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯損傷；ALI組大鼠可見(jiàn)肺間質(zhì)水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺泡明顯減少等病理?yè)p傷；與ALI組比較，BB低、高劑量組及地塞米松陽(yáng)性組肺間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷明顯減輕；與BB低劑量組比較，BB高劑量組及地塞米松陽(yáng)性組肺組織水腫及病理?yè)p傷進(jìn)一步減輕，見(jiàn)圖1。

2.2 BB對(duì)大鼠肺組織MPO、IL-6、TNF-α含量的影響 與Sham組相比，ALI組大鼠肺組織MPO、TNF-α、IL-6水平均明顯升高(P<0.05)；與ALI組相比，BB低、高劑量組及地塞米松陽(yáng)性組大鼠肺組織MPO、TNF-α、IL-6水平均降低明顯(P<0.05)；與BB低劑量組相比，BB高劑量組及地塞米松陽(yáng)性組大鼠肺組織MPO、TNF-α、IL-6水平均降低明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 BB對(duì)大鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)及NF-κB活性的影響 與Sham組相比，ALI組大鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)、NF-κB活性均明顯升高(P<0.05)；與ALI組相比，BB低、高劑量組及地塞米松陽(yáng)性組大鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)、NF-κB活性水平均明顯降低(P<0.05)；與BB低劑量組相比，BB高劑量組及地塞米松陽(yáng)性組大鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)、NF-κB活性水平均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

圖1 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理?yè)p傷狀態(tài)(100×)

表1 各組大鼠肺組織MPO、TNF-α、IL-6水平

圖2 大鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)免疫印跡圖

表2 各組大鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)、NF-κB蛋白活性比較

2.4 BB對(duì)大鼠肺組織Th1/Th2平衡的影響 與Sham組相比，ALI組大鼠Th1/Th2、TNF-α/IL-6均明顯降低(P<0.05)；與ALI組相比，BB低、高劑量組及地塞米松陽(yáng)性組大鼠肺組織Th1/Th2、TNF-α/IL-6均明顯升高(P<0.05)；與BB低劑量組相比，BB高劑量組及地塞米松陽(yáng)性組大鼠肺組織Th1/Th2、TNF-α/IL-6均明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肺組織Th1/Th2、TNF-α/IL-6水平比較

3 討論

膿毒癥引起的ALI發(fā)病率、死亡率較高，嚴(yán)重影響人類生命健康[13]。機(jī)體促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)失衡是膿毒癥ALI機(jī)體炎癥反應(yīng)失控的主要表現(xiàn)，T輔助淋巴細(xì)胞Th1/Th2能反映機(jī)體促炎和抗炎反應(yīng)失衡情況[14]。Th1細(xì)胞主要分泌TNF-α、IL-2等促炎因子，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-6、IL-10等抗炎因子，機(jī)體正常時(shí)，Th1/Th2處于動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體正常細(xì)胞和體液免疫，膿毒癥感染過(guò)程中，早期以Th1反應(yīng)為主，晚期以Th2反應(yīng)為主，促炎和抗炎介質(zhì)增多，預(yù)示病情嚴(yán)重及預(yù)后不良[15]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿刺手術(shù)建立膿毒癥ALI模型，發(fā)現(xiàn)與Sham組相比，ALI模型組大鼠肺組織出現(xiàn)水腫、出血、炎性損傷等病理?yè)p傷現(xiàn)象，且肺組織TNF-α、IL-6含量明顯增高，且TNF-α/IL-6、Th1/Th2明顯降低，提示ALI模型組大鼠體內(nèi)Th1/Th2平衡失調(diào)，促炎和抗炎反應(yīng)紊亂，肺組織出現(xiàn)炎癥損傷，表明膿毒癥ALI模型造模成功。

目前，臨床上治療膿毒癥ALI無(wú)明顯特效藥物，而使用抗炎藥物抑制TNF-α、IL-10等促炎和抗炎介質(zhì)釋放，使Th1/Th2趨于平衡，可緩解肺組織損傷[14-16]。BB為銀杏種子的主要活性物質(zhì)，對(duì)心絞痛、冠心病、高血壓等心腦血管疾病有較好療效。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，BB可治療卡氏肺孢子蟲(chóng)肺炎[8-9]。另外董志超[17]也發(fā)現(xiàn)，BB可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路激活，降低炎癥反應(yīng)，緩解肝炎模型大鼠肝纖維化程度?；贐B抗炎及對(duì)肺炎的保護(hù)作用，本研究推測(cè)BB可能對(duì)膿毒癥ALI有一定的改善作用，并建立膿毒癥ALI模型，對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與ALI組相比，BB低、高劑量及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織水腫、出血、炎性損傷等病理?yè)p傷明顯均減輕，TNF-α、IL-6含量降低、TNF-α/IL-6、Th1/Th2明顯升高，且BB高劑量組優(yōu)于低劑量組，表明BB可能通過(guò)抑制TNF-α、IL-10等炎性相關(guān)因子釋放，調(diào)節(jié)Th1/Th2使其趨于正常，減輕膿毒癥ALI大鼠肺組織中炎應(yīng)損傷。

MPO是存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的一種代謝酶，其活性水平變化可反映單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活性和功能狀態(tài)，反映肺組織的損傷程度[18-19]。膿毒癥早期，炎癥介質(zhì)和內(nèi)毒素會(huì)刺激激單核和巨噬細(xì)胞活化，使TLR4受體激活，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)NF-κB表達(dá)，從而使IL-6和TNF-α等炎性介質(zhì)大量釋放，導(dǎo)致毛細(xì)血管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，造成肺組織結(jié)構(gòu)及功能損壞[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，ALI模型組大鼠肺組織MPO活性、IL-6、TNF-α炎性因子含量、TLR4蛋白表達(dá)量及NF-κB活性均明顯升高，提示膿毒癥ALI大鼠肺組織損傷，可能與中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活化，TLR4/NF-κB激活，IL-6、TNF-α等炎性因子水平增高有關(guān)。而給予BB低、高劑量及地塞米松治療后，大鼠肺組織MPO活性、IL-6、TNF-α炎含量、TLR4表達(dá)量及NF-κB活性均顯著低于ALI模型組，且BB高劑量組明顯低于BB低劑量組，表明BB可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路，抑制炎性介質(zhì)釋放，降低炎性反應(yīng)，改善膿毒癥誘導(dǎo)的ALI肺組織損傷。

4 結(jié)論與啟示

白果內(nèi)酯可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，減少炎性介質(zhì)釋放，改善膿毒癥ALI大鼠肺組織損傷，可能為膿毒癥ALI的臨床治療提供新思路。但本文未設(shè)置上調(diào)及抑制該信號(hào)通路進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，存在一定不足，有待后續(xù)深入研究。