翹芩清肺劑中藥免煎顆粒劑與飲片劑的抑菌作用比較

梁慧玲 韓 超 鄭琳穎 張秋玲 劉道利 周偉青

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院(廣州 510130)

呼吸道感染是臨床常見感染性疾病，多見于金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,下簡稱SA)，鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，下簡稱Aba)。2017年國內(nèi)CHINET 監(jiān)測發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌耐藥仍保持高位。MRSA的耐藥率在33.2%,但發(fā)現(xiàn)利奈唑胺、替加環(huán)素、達(dá)托霉素等新藥物開始出現(xiàn)不敏感菌株[1- 2]。尋找新的抗菌藥物或藥物增效劑迫在眉睫。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療感染性疾病方面具有悠久歷史，中西醫(yī)結(jié)合治療，可為臨床合理應(yīng)用抗菌素的提供更多的選擇性。翹芩清肺劑是我院純中藥院內(nèi)制劑，由連翹、黃芩、荊芥等十種藥物組成，臨床應(yīng)用四十余年，在治療感冒咳嗽、急慢性支氣管炎等方面療效顯著。我們前期研究發(fā)現(xiàn)翹芩清肺劑可有效減輕氣道炎癥反應(yīng)[3- 5]。本研究采用KB試紙擴(kuò)散法和改良液體稀釋法檢測翹芩清肺劑的中藥免煎顆粒劑(下簡稱顆粒劑)與飲片煎煮劑(下簡稱煎煮劑)藥液在體外對金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌的抑菌效果及其藥物敏感性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923、鮑曼不動桿菌ATCC19606，購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物與試劑

翹芩清肺劑(下簡稱翹芩，由廣州市中醫(yī)醫(yī)院制備，2.5 kg 生藥量/L)。血瓊脂平板、MH增菌肉湯和空白藥敏紙片均購自江門凱琳貿(mào)易有限公司，MH平板購自廣州康斯特生物科技有限公司。

1.3 儀器

AIRTECH二級生物安全柜(蘇凈安泰公司)。SPX- 250B-Z型生化培養(yǎng)箱(海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。KHB ST- 360酶標(biāo)儀(上海科華實驗系統(tǒng)有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥液配置 根據(jù)前期實驗[4]按翹芩的等效劑量將相應(yīng)的免煎顆粒劑加水煮沸完全溶解后，濃縮到10 g/mL生藥量。煎煮劑按傳統(tǒng)方式煎煮，浸泡后煎煮兩次，把兩次所得的藥汁混勻濃縮到10 g/mL生藥量。兩者經(jīng)高壓消毒后，用MH肉湯進(jìn)行對倍稀釋。最后翹芩的顆粒劑待測濃度為10 g/mL，5.5 g/mL，2.75 g/mL，1.38 g/mL，0.69 g/mL。翹芩煎煮劑待測濃度為5.5 g/mL，2.75 g/mL，1.38 g/mL，0.69 g/mL。

1.4.2 菌液配置 把SA、Aba用小牛血清溶解后血平板培養(yǎng)，在37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取單個菌落再次分純培養(yǎng)，取其二代菌株用生理鹽水調(diào)配成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，再稀釋?:150的菌液。

1.4.3 藥敏紙片制作 把翹芩顆粒劑10 g/mL，5.5 g/mL，2.75 g/mL，1.38 g/mL,0.69 g/mL，煎煮劑5.5 g/mL，2.75 g/mL，1.38 g/mL,0.69 g/mL用微量移液槍吸20 μL藥液放在空白藥敏紙片中，室溫放置30 min待完全吸收，干燥。

1.4.4 KB檢測 KB法檢測時分別 把SA、Aba 0.5麥?zhǔn)蠞岫染和吭贛H平板上。把顆粒劑含10 g/mL，5.5 g/mL，2.75 g/mL，1.38 g/mL,0.69 g/mL的藥敏紙片貼在MH平板上。把煎煮劑含5.5 g/mL，2.75 g/mL，1.38 g/mL,0.69 g/mL的藥敏紙片貼在MH平板上。每組每個濃度重復(fù)12次。取一環(huán)SA、Aba菌液劃在MH平板上觀察細(xì)菌作陽性對照。把顆粒劑、煎煮劑組各濃度的藥敏紙片貼在空白MH平板作空白對照。在37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察其抑菌圈大小。

1.4.5 最小抑菌濃度MIC檢測 采用改良液體稀釋法。取經(jīng)滅菌的96孔聚苯乙烯板，把顆粒劑10 g/mL，5.5 g/mL，2.75 g/mL，1.38 g/mL,0.69 g/mL 的藥液用微量移液槍吸50 μL在微量孔里，再加1:150的SA 菌液50 μL，每個濃度重復(fù)9次。把煎煮劑5.5 g/mL，2.75 g/mL，1.38 g/mL,0.69 g/mL的藥液吸50 μL在微量孔里，再加1:150的SA 菌液50 μL，每個濃度重復(fù)9次。Aba同樣操作?？瞻讓φ眨侯w粒劑各濃度的藥液取50 μL和等量的無菌生理鹽水混勻。每個濃度一孔，共5孔。煎煮劑4個濃度各取50 μL和等量的無菌生理鹽水混勻。每個濃度一孔。陽性對照：取50 μL SA、Aba菌液加在微量孔里。把所有聚苯乙烯板放在有蓋容器里在37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后判斷結(jié)果。將培養(yǎng)后的檢測物與空白組對比，用酶標(biāo)儀比色，490吸光度觀察其OD值變化。以相同濃度下與空白對照最接近值最小抑菌濃度[6]。

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計，MIC 值比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KB法觀察翹芩清肺劑免煎顆粒劑和飲片煎煮劑對SA和Aba的抑菌作用

實驗數(shù)據(jù)顯示，翹芩顆粒劑在濃度10.0 g/mL、濃度5.5 g/mL和濃度2.75 g/mL時對SA抑菌作用明顯(P值分別為P<0.001、P<0.001、P<0.001),最低抑菌濃度為2.75 g/mL。煎煮劑在濃度5.5 g/mL、濃度2.75 g/mL和濃度1.38 g/mL時對SA抑菌作用明顯(P值分別為P<0.001、P=0.001、P<0.001),最低抑菌濃度為1.38 g/mL。在Aba作用方面，顆粒劑在濃度10.0 g/mL和濃度5.5 g/mL 抑菌作用明顯(P值分別為P<0.001、P=0.004),最低抑菌濃度為5.5 g/mL，煎煮劑在濃度5.5 g/mL和濃度2.75 g/mL 抑菌作用明顯(P值分別為P<0.001、P=0.002，P<0.01), 最低抑菌濃度為2.75 g/mL。 結(jié)果見表1。

表1 翹芩清肺劑顆粒沖服劑和飲片煎煮劑對SA和Aba的抑菌圈直徑(mm)

2.2 翹芩清肺劑免煎顆粒劑和飲片煎煮劑對SA和Aba的抑菌效果分析

根據(jù)SA和Aba的抑菌圈直徑顯示，在藥液濃度5.5 g/mL和1.38 g/mL時，顆粒劑和煎煮劑對SA均有抑菌性，(P值均為P<0.001)，而在濃度2.75 g/mL時，兩者對SA的抑菌效果均不明顯(P=0.424)。在藥液濃度為5.5 g/mL和2.75 g/mL時，顆粒劑和煎煮劑均能有效抑制Aba(P值均為P<0.001)。從抑菌圈的大小進(jìn)行比較，由圖1、3可見，在藥物濃度為5.5 g/mL時，顆粒劑的SA抑菌圈比飲片煎煮劑較小，煎煮劑的抑菌效果較顆粒劑為好。由圖2、4可見，濃度2.75 g/mL 時，顆粒劑與煎煮劑的SA抑菌圈無差異。結(jié)果見表2，圖1- 4。

表2根據(jù)SA和Aba的抑菌圈直徑對翹芩清肺劑顆粒沖服劑和飲片煎煮劑效果對比分析 mm

圖1 SA顆粒沖服劑5.5 g/mL

圖2 SA顆粒沖服劑2.75 g/mL

圖3 SA飲片煎煮劑5.5 g/mL

圖4 SA飲片煎煮劑2.75 g/mL

2.3 改良液體稀釋法測定翹芩清肺劑顆粒沖服劑和飲片煎煮劑對SA和Aba的最低抑菌濃度

表3使用改良液體稀釋法顯示顆粒劑對SA實驗中，濃度5.5 g/mL和濃度2.75 g/mL濃度1.38 g/mL、濃度0.69 g/mL與空白對照有差異性(P值分別為P=0.010、P<0.001、P<0.001、P<0.001)。SA的最小抑菌濃度是10 g/mL。對Aba濃度2.75 g/mL濃度1.38 g/mL、濃度0.69 g/mL與空白對照有差異性(P均<0.001)。Aba的最小抑菌濃度是5.5 g/mL。煎煮劑濃度2.75 g/mL濃度1.38 g/mL、濃度0.69 g/mL與空白對照有差異性(P均<0.001)。以相同濃度下與空白對照最接近值作最小抑菌濃度，因此對顆粒劑SA最小抑菌濃度均為10.0 g/mL,Aba最小抑菌濃度均為5.5 g/mL。煎煮劑兩菌MIC均為5.5 g/mL。結(jié)果見表3、表4。

表3翹芩清肺劑顆粒沖服劑對SA和Aba的最低抑菌濃度(MIC)

表4翹芩清肺劑片煎煮劑對SA和Aba的最低抑菌濃度(MIC)

3 討 論

Aba是革蘭氏陰性桿菌，屬條件致病菌，目前發(fā)現(xiàn)在抵抗力低下的病人痰標(biāo)本中分離率越來越高[7]。由于藥物滅活酶、主動外排泵等機(jī)制導(dǎo)致其對多種抗生素耐藥率大于70%[1,8]。SA是常見的肺炎致病菌,容易社區(qū)性獲得[9]。近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)替考拉寧、利奈唑胺、替加環(huán)素、達(dá)托霉素耐藥株[2]。因此尋找新的有效藥物治療耐藥菌刻不容緩。

本實驗觀察及對比了翹芩清肺劑的免煎顆粒劑和飲片煎煮劑在體外對Aba和SA的抑菌效果。結(jié)果顯示，在KB法和液體稀釋法中，兩者在濃度10.0 g/mL時，均能顯著抑制SA和Aba生長，其中對Aba的抑菌效果較SA弱，但兩者無顯著性差異性。在KB法中，藥物濃度在5.5 g/mL及2.75 g/mL時,對Aba煎煮劑抑菌圈分別為9 mm、7 mm; 顆粒劑抑菌圈為7 mm和6 mm。藥物濃度5.5 g/mL和1.38 g/mL時，煎煮劑對SA的抑菌圈分別為14 mm、12 mm；顆粒劑抑菌圈分別為7 mm和6 mm，兩者有差異。顯示飲片煎煮劑的效果比顆粒劑效果較好。

中藥在抗菌方面的應(yīng)用已有幾千年的歷史，許多研究表明中藥飲片對多重耐藥細(xì)菌有明顯的抑菌作用。由于其有效成分復(fù)雜、作用靶點多、抗菌譜廣，較少細(xì)菌對其產(chǎn)生耐藥性，在抑菌殺菌方面占有獨特的優(yōu)勢，延緩甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。據(jù)此研究中藥對耐藥菌的作用，尋找有效、低毒的抗菌藥物，開發(fā)利用中藥制劑解決細(xì)菌耐藥性這一難題，為目前一種新的有效途徑。

一直以來，中醫(yī)臨床用藥的傳統(tǒng)劑型均以飲片水煎劑為主，各種中藥經(jīng)過浸泡，先煎或后下，煎煮時各藥物成分之間經(jīng)過吸附、增溶、助溶、沉淀、水解、中和、氧化、還原等一系列反應(yīng)后，發(fā)揮出其應(yīng)有的藥效。中藥免煎顆粒是中藥材經(jīng)過前處理，利用浸提法，選取合適的溶媒和方法，析出有效成分，經(jīng)過濃縮干燥后，按一定比例制成的新型中藥單味制劑，不同的中藥有不同的提取及制粒方法[10-11]。研究證明，不同的制備方法，與藥效的關(guān)系有著千絲萬縷的關(guān)系，可能增加，可能減弱，也可能無明顯差異。我們的實驗結(jié)果顯示，對于SA，在濃度2.75 g/mL水顆粒劑和煎煮劑抑菌性無明顯差異(P>0.05)。

煎煮法的KB實驗結(jié)果顯示，SA最低抑菌濃度是1.38 g/mL，Aba最低抑菌濃度是2.75 g/mL。改良液體稀釋法SA和Aba最低抑菌濃度是5.50 g/mL。結(jié)果顯示兩種方法的抑菌濃度有差異，我們推斷其原因可能與檢測方法學(xué)有關(guān)。KB法是通過抑菌圈直徑進(jìn)行比較，評估藥物的抑菌效果。改良液體稀釋法則是通過分光光度計比色測定MIC。一般來說，稀釋法測出的藥物抗菌效力會比擴(kuò)散法要大些，原因與中藥的提取液為混懸液，在固體培養(yǎng)基上的擴(kuò)散性受到一定的限制。但我們結(jié)果顯示，KB法的MIC抑菌濃度比稀釋法小。原因我們推測可能與翹芩清肺劑煎煮劑濃縮后質(zhì)地濃稠，使用96孔聚苯乙烯板做液體稀釋法，可能引起中藥沉淀，影響實驗結(jié)果[12]。

復(fù)方中藥成分復(fù)雜，采用傳統(tǒng)煎煮法的湯劑效果與中藥單味免煎顆粒的混合沖劑液之間的效果的差異性仍需要多方面研究觀察，客觀評價。如中藥方劑各藥材質(zhì)量、質(zhì)地各異，經(jīng)高溫融合后液體稠度較濃，有待改善煎煮法的方式減輕對實驗的影響。中草藥在抗病毒、抗炎癥、增強(qiáng)人體抵抗力方面發(fā)揮著重要作用，進(jìn)一步探討和對比不同中藥制劑對體內(nèi)外抑菌效果，對臨床醫(yī)學(xué)研究有著積極作用。在本實驗中，我們探討了翹芩清肺劑對SA、Aba有抑菌作用，為后續(xù)研究翹芩清肺劑的作用機(jī)制研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。