鯰魚頭/魚排酶解方式和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

于德陽　馬儷珍

摘 要：利用革胡子鯰魚的加工副產(chǎn)物鯰魚頭/魚排，在高壓浸提液的基礎(chǔ)上，經(jīng)分步酶解再發(fā)酵，制備魚味美拉德反應(yīng)香料基料。結(jié)果表明：經(jīng)過分步酶解法，酶解液中游離氨基酸總量是高壓浸提液的6.09 倍，其中谷氨酸含量由0增加至6.67 mg/100 g，天冬氨酸、絲氨酸、蛋氨酸含量分別是高壓浸提液的3.10、82.71、8.43 倍;利用單因素及Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)選出最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為選用SHI-59發(fā)酵劑、接種量0.024%、發(fā)酵溫度34.0 ℃、發(fā)酵時(shí)間53.0 h，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量理論值達(dá)0.250%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為0.256%。通過分步酶解再發(fā)酵可以顯著提高魚骨肉泥中的風(fēng)味前體物質(zhì)含量。

關(guān)鍵詞：鯰魚頭;鯰魚排;高壓浸提;酶解;發(fā)酵

Optimization of Enzymatic Hydrolysis and Fermentation Conditions of Catfish Heads/Bones

YU Deyang， MA Lizhen*

（College of Food Science and Biotechnology， Tianjin Agriculture University， Tianjin 300384， China）

Abstract： Catfish heads/bones， a by-product of catfish processing， was extracted with water under high pressure conditions， sequentially hydrolyzed with two different proteases， and fermented for use in the preparation of fish flavoring by the Maillard reaction. The results showed that the total amount of free amino acids in the hydrolysate was 6.09 times of that in the high-pressure extract， among which the content of glutamic acid increased from 0 to 6.67 mg/100 g， and the contents of aspartic acid， serine and methionine were 3.10， 82.71 and 8.43 times respectively compared with those in the high-pressure extract， respectively. Using one-factor-at-a-time method and Box-Behnken design response surface methodology， the optimal fermentation parameters were found to be fermentation at 34.0 ℃ for 53.0 h using the mixed starter culture SHI-59 with an inoculum size of 0.024%. The theoretical value of amino acid nitrogen content in the fermentation broth was 0.250%， close to the experimental value of 0.256%. The content of flavor precursors could be significantly increased after enzymatic hydrolysis and then fermentation.

Keywords： catfish heads; catfish bones; high pressure extraction; enzymatic hydrolysis; fermentation

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210119-015

中圖分類號(hào)：TS254.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2021）01-0019-07

引文格式：

于德陽， 馬儷珍. 鯰魚頭/魚排酶解方式和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化[J]. 肉類研究， 2021， 35（1）： 19-25. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210119-015. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

YU Deyang， MA Lizhen. Optimization of enzymatic hydrolysis and fermentation conditions of catfish heads/bones[J]. Meat Research， 2021， 35（1）： 19-25. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210119-015. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

近年來，隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)日趨合理，水產(chǎn)品總量不斷增加，但水產(chǎn)品加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，如魚頭、魚骨、魚皮、魚鱗、魚內(nèi)臟及其殘留魚肉等占到原料質(zhì)量的45%左右，如果不能合理利用，不僅浪費(fèi)嚴(yán)重，還會(huì)大大增加環(huán)境治理成本[1]。目前，水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的綜合利用一直以研究魚粉、魚油及開發(fā)飼料蛋白為熱點(diǎn)[2]，而以其為基料進(jìn)行酶解、發(fā)酵開發(fā)調(diào)味品的研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，魚頭、魚骨中蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類齊全、組成平衡[3]。通過酶解工藝，可以改善酶解產(chǎn)物的風(fēng)味，提高酶解液中游離氨基酸總量和呈味氨基酸含量。Nilsang等[4]用風(fēng)味蛋白酶對(duì)水產(chǎn)罐頭加工副產(chǎn)品進(jìn)行酶解，研究發(fā)現(xiàn)，在45 ℃條件下酶解6 h，得到的酶解液苦味較小，風(fēng)味較好。陳祖杰等[5]利用胰蛋白酶水解魚蛋白質(zhì)，使魚蛋白質(zhì)在酶的作用下水解成為肽和氨基酸，易溶于水，有利于人體的吸收，混合成的復(fù)合調(diào)味料是一種含高蛋白且具有魚香味的調(diào)味料。蛋白水解產(chǎn)物不僅具有降血壓、抗氧化等特性，還可產(chǎn)生很多呈味核苷酸和游離氨基酸，使得酶解液有很好的風(fēng)味，可以用于制備調(diào)味基料[6]。

鯰魚骨和鯰魚頭占鯰魚體質(zhì)量的30%～40%[7]，粗脂肪含量達(dá)16.6%，而脂肪及脂類物質(zhì)的熱降解對(duì)肉類風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要作用[8]。樊玲芳等[9]對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚頭和魚頭酶解物干燥粉的風(fēng)味成分進(jìn)行分析和比較，結(jié)果表明，魚頭和魚頭酶解物中均含有豐富的氨基酸。裘迪紅等[10]研究魚蛋白水解液的脫苦脫腥，結(jié)果表明，苦味的產(chǎn)生主要是由于蛋白質(zhì)在酶解過程中產(chǎn)生了苦味肽，即末端為疏水性氨基酸的肽。密更等[11]研究表明，常見發(fā)酵魚制品中優(yōu)勢(shì)乳酸菌為植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、戊糖乳桿菌及戊糖片球菌等。曾少葵等[12]用乳酸菌對(duì)羅非魚酶解液進(jìn)行發(fā)酵，能有效減弱酶解液的腥味，同時(shí)發(fā)酵后增加的酯類、辛酸及十六醛等物質(zhì)能明顯改善酶解液的風(fēng)味。馬海霞等[13]研究表明，乳酸菌發(fā)酵羅非魚骨粉的最適發(fā)酵條件為發(fā)酵8 d、接種量8%、葡萄糖用量5%、溫度37 ℃、骨粉粒徑<0.075 mm。張弦[14]研究復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)魚肉香腸品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，發(fā)酵過程中魚肉香腸的氨基酸態(tài)氮含量顯著升高。Shih等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在魚露發(fā)酵過程中，紫紅曲霉的加入能夠顯著促進(jìn)魚露風(fēng)味。張鋒[16]通過實(shí)驗(yàn)證明，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶適用于鯰魚頭的水解。

傳統(tǒng)的魚味調(diào)味料大多熱穩(wěn)定性差，香氣成分受熱揮發(fā)嚴(yán)重，在終端產(chǎn)品中加香效果不夠理想。因此，本研究選用復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，以鯰魚頭、鯰魚排為基料，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳的酶解和發(fā)酵條件，以獲得更多的風(fēng)味前體物質(zhì)，為指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

革胡子鯰魚（Clarias gariepinus），體質(zhì)量1 000～1 500 g，體長(zhǎng)30～35 cm，天津市徳仁農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，在30 min內(nèi)從工廠養(yǎng)魚池送到學(xué)校食品加工車間。

復(fù)合蛋白酶（400 000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（3 600 U/g）

南寧東恒華道生物科技有限公司;THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌）、WBX-43（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌）、SHI-59（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）、PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+類植物乳桿菌+清酒乳桿菌）發(fā)酵劑 意大利薩科公司;甲醛、氫氧化鈉、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、苯酚、淀粉酶、葡萄糖、碘化鉀、碘、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸、鹽酸、甲基紅、乙醇、溴甲酚綠、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YX-18LM高壓滅菌鍋 上海三神醫(yī)療器械有限公司;WND-100高速組織搗碎機(jī) 浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司;ATY124精密分析天平 日本島津公司;THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;ZWY-240全溫型多振幅軌道搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;DW-50調(diào)溫電熱器 南通利豪實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SX-GO7102節(jié)能箱式電爐 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;SDX-1全自動(dòng)風(fēng)冷速凍箱 天津市特斯達(dá)食品機(jī)械科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

魚頭/魚排→粉碎→高壓浸提→酶解→魚骨肉泥酶解液→發(fā)酵

1.3.2 魚骨肉泥的制備

將魚頭和中間的魚排清洗干凈，用絞肉機(jī)（5 mm篩板）絞碎后得到魚骨肉泥。用自封袋包裝后放入速凍箱（-30 ℃）中速凍1 h，然后-18 ℃冷凍貯藏備用。經(jīng)測(cè)定，所得到的魚骨肉泥基本組成為：蛋白質(zhì)含量13.64%、脂肪含量16.6%、水分含量38.93%、總糖含量6.23%、總灰分含量6.78%。

1.3.3 魚骨肉泥高壓浸提液的制備

參照楊婉琳[17]方法并加以修改，將魚骨肉泥按料水比1∶2的比例加入蒸餾水，在壓力0.1 MPa、溫度120 ℃、時(shí)間2 h的高壓浸提條件下，得到魚骨肉泥高壓浸提液，進(jìn)行游離氨基酸組成分析。

1.3.4 魚骨肉泥酶解液的制備

分步酶解液制備方法：將1.3.3節(jié)的高壓浸提液冷卻至55 ℃，調(diào)整pH值為7.5，100 g魚骨肉泥加入1 200 U/g復(fù)合蛋白酶，55 ℃酶解2 h（攪拌轉(zhuǎn)速為180 r/min），然后再加入720 U/g風(fēng)味蛋白酶，繼續(xù)酶解1 h，升溫到95 ℃滅酶10 min，得到分步酶解液，進(jìn)行游離氨基酸組成分析。

一步酶解液制備方法：處理方法同分步酶解，只是將相同添加量的復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶同時(shí)加入到冷卻至55 ℃的高壓浸提液中，55 ℃酶解3 h，隨后升溫到95 ℃滅酶10 min，得到一步酶解液，進(jìn)行游離氨基酸組成分析。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5.1 發(fā)酵劑種類對(duì)發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量的影響

配制30 g/100 mL葡萄糖溶液，滅菌（121 ℃、20 min），按照終體積分?jǐn)?shù)2%的比例加入到分步酶解液中，搖動(dòng)混勻。準(zhǔn)備經(jīng)高壓滅菌（121 ℃、20 min）后的250 mL錐形瓶57 個(gè)，在每個(gè)錐形瓶中無菌操作加入100 mL上述溶液。

用無菌生理鹽水將THM-17、WBX-43、SHI-59、PRO-MIX5 4 種發(fā)酵劑配制成質(zhì)量濃度為10 g/100 mL的菌液。取12 個(gè)裝有分步酶解液的錐形瓶，每組3 個(gè)平行，分別接入體積分?jǐn)?shù)0.02%的4 種發(fā)酵劑菌液。接菌后放入35 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量。

根據(jù)1.3.5.1節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，在4 種發(fā)酵劑中，SHI-59的效果最佳，因此以下單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中采用SHI-59作為試驗(yàn)用發(fā)酵劑。

1.3.5.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量的影響

在15 個(gè)裝有分步酶解液的錐形瓶中，接入0.02%的SHI-59發(fā)酵劑，分別在25、30、35、40、45 ℃溫度下恒溫?fù)u床培養(yǎng)36 h，搖床轉(zhuǎn)速為30 r/min，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量，選出最佳的發(fā)酵溫度。

1.3.5.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量的影響

在15 個(gè)裝有分步酶解液的錐形瓶中，接入0.02%的SHI-59發(fā)酵劑，在30 ℃（按照1.3.5.2節(jié)的結(jié)果）恒溫?fù)u床發(fā)酵，搖床轉(zhuǎn)速為30 r/min，分別在發(fā)酵12、24、36、48、60 h取樣測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量，選出最佳的發(fā)酵時(shí)間。

1.3.5.4 發(fā)酵劑添加量對(duì)發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量的影響

在15 個(gè)裝有分步酶解液的錐形瓶中，分別接入0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%的SHI-59發(fā)酵劑，30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)36 h（按照1.3.5.3節(jié)的結(jié)果），搖床轉(zhuǎn)速為30 r/min，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量，選出適宜的發(fā)酵劑添加量。

1.3.6 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.3.5節(jié)的單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型，以SHI-59為發(fā)酵劑，選擇發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵劑添加量（C）3 個(gè)因素之間兩兩交互作用對(duì)發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量變化的影響進(jìn)行響應(yīng)面分析。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

1.3.7 指標(biāo)測(cè)定

氨基酸態(tài)氮含量：按照GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的方法測(cè)定;游離氨基酸組成及含量：采用氨基酸分析儀測(cè)定;蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的常量凱氏定氮法;粗脂肪含量：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》;水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法;總糖含量：參照GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測(cè)定》;總灰分含量：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)均取3 次平行試驗(yàn)的平均值。采用Excel 2016軟件進(jìn)行圖表制作，采用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行顯著性分析，差異顯著水平為0.05，采用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓浸提液、一步酶解液、分步酶解液的游離氨基酸組成分析

由表2可知，高壓浸提液檢測(cè)出24 種游離氨基酸，酶解液中檢測(cè)出25 種游離氨基酸，酶解過程能夠顯著提高游離氨基酸總含量，經(jīng)過一步酶解和分步酶解后，游離氨基酸總量分別是高壓浸提液的3.42 倍和6.09 倍，分步酶解液是一步酶解液的1.78 倍，這是由于復(fù)合蛋白酶是內(nèi)切酶，會(huì)從肽鏈中相應(yīng)的位點(diǎn)將肽鏈切斷，使內(nèi)部疏水氨基酸暴露出來，而風(fēng)味蛋白酶屬于外切酶，會(huì)從肽鏈的一端逐步將氨基酸切下來[17]。這與Ko等[18]研究結(jié)果基本一致。不同種類的蛋白酶協(xié)同酶解效率更高，原因是不同種類的蛋白酶水解位點(diǎn)的差異性和互補(bǔ)性。在復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的共同作用下，游離氨基酸總量顯著增加，這與張鋒[16]研究的鯰魚頭經(jīng)雙酶酶解結(jié)果一致。氨基酸是美拉德反應(yīng)的前體物，游離氨基酸的組成及含量均對(duì)調(diào)味基料的風(fēng)味起著重要作用[19]。

通過分析一步酶解液和分步酶解液中游離氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，一步酶解液相對(duì)于高壓浸提液來說，有8 種游離氨基酸（牛磺酸、天冬酰胺、α-氨基己二酸、甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、鳥氨酸、脯氨酸）含量出現(xiàn)降低趨勢(shì);分步酶解液相對(duì)于高壓浸提液來說，只有α-氨基己二酸含量降低，其他游離氨基酸含量均明顯增加。

谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺是重要的鮮味氨基酸。分步酶解液和一步酶解液鮮味氨基酸含量分別是高壓浸提液的2.40 倍和0.73 倍，增加幅度最顯著的是谷氨酸。一步酶解液中谷氨酸的檢出量為1.99 mg/100 g，分步酶解液中谷氨酸的檢出量為6.67 mg/100 g，而高壓浸提液中谷氨酸未檢出;一步酶解液和分步酶解液的天冬酰胺含量分別是高壓浸提液的1.93 倍和3.10 倍，絲氨酸含量分別是高壓浸提液的3.29 倍和82.71 倍。分步酶解液中苦味氨基酸和甜味氨基酸含量分別是高壓浸提液的12.14 倍和12.42 倍，是一步酶解液的2.00 倍和3.29 倍。甜味氨基酸和鮮味氨基酸作為良好呈味基料的基礎(chǔ)，可以呈現(xiàn)良好的滋味[20-21]，其中甜味氨基酸中的甘氨酸雖然增幅不大，但其本身具有爽快的甜味，酶作用于蛋白質(zhì)中甘氨酸殘基羧基參與形成的肽鍵，產(chǎn)生的苦味氨基酸較少，氨基酸得率高[22]。分步酶解液中的甜味氨基酸和鮮味氨基酸占總量的42.17%，一步酶解液中甜味氨基酸和鮮味氨基酸占總量的35.72%。經(jīng)分步酶解后小分子肽和呈醇厚口感的肽增多，所以分步酶解液可以提供良好的風(fēng)味。

一步酶解液和分步酶解液中蛋氨酸含量分別是高壓浸提液的3.49 倍和8.43 倍。2 種酶解液中均未檢出半胱氨酸，所以在后期可通過發(fā)酵工藝或在美拉德反應(yīng)基質(zhì)中添加半胱氨酸。蛋氨酸和半胱氨酸是含硫氨基酸，可以在美拉德反應(yīng)的中間階段通過Strecker降解產(chǎn)生硫化氫和氨類物質(zhì)，對(duì)大量雜環(huán)風(fēng)味化合物的形成提供前體物質(zhì)，從而產(chǎn)生濃郁的肉香氣[23]。因此，在制備肉味美拉德反應(yīng)基料時(shí)通常需要添加含硫氨基酸作為反應(yīng)底物。

從以上分析可以看出，分步酶解液中的游離氨基酸總量、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、蛋氨酸的含量較高壓浸提液和一步酶解液均有不同程度提高，且這些氨基酸均對(duì)風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。有研究表明，酶解液和發(fā)酵液比較，發(fā)酵前后的風(fēng)味成分有明顯變化，說明發(fā)酵能改善酶解液的風(fēng)味[24]，因此，選擇分步酶解液接種商業(yè)復(fù)合發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，可為美拉德反應(yīng)提供更多的反應(yīng)前體物。

2.2 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵劑種類的確定

在分步酶解液中分別接種4 種復(fù)合發(fā)酵劑，有研究[25]表明，混合發(fā)酵劑可以改善產(chǎn)品風(fēng)味、提高營養(yǎng)價(jià)值。

小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。下同。

由圖1可知，發(fā)酵液中的氨基酸態(tài)氮含量差異顯著（P<0.05），氨基酸態(tài)氮含量從高到低的順序依次為SHI-59發(fā)酵液>WBX-43發(fā)酵液>THM-17發(fā)酵液>Pro-mix5發(fā)酵液，特別是經(jīng)SHI-59作用的發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量高達(dá)0.23%，而Pro-mix5發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量?jī)H為0.03%。分析原因，可能是由于酶解液經(jīng)SHI-59中的木糖葡萄球菌、戊糖片球菌中的蛋白酶和脂肪酶系酶解，促進(jìn)酶解液蛋白的水解，加速小分子肽和游離氨基酸的生成，而SHI-59中的植物乳桿菌也能促進(jìn)蛋白水解，并能抑制有害微生物的繁殖，此3 種混合菌形成一個(gè)良好的體系。因此，選擇SHI-59發(fā)酵劑作為單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)所用的發(fā)酵劑。

2.2.2 發(fā)酵溫度的確定

由圖2可知，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵溫度升高而升高，這是由于微生物在適宜的溫度下繁殖較快，分泌蛋白酶能力強(qiáng)，促進(jìn)了肽和氨基酸的生成。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大值。氨基酸態(tài)氮是以氨基酸形式存在的氮元素，并不是一種獨(dú)立的物質(zhì)，其含量間接反映游離氨基酸的含量。隨著發(fā)酵溫度的升高，氨基酸態(tài)氮含量呈顯著下降趨勢(shì)，可能是由于溫度超過了微生物的最適溫度，因此發(fā)酵能力下降，此結(jié)果和張蕓等[26]的分析結(jié)果基本一致。因此，最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大值，主要是由于初始階段微生物繁殖較快，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解加快。當(dāng)發(fā)酵48 h后，由于發(fā)酵液中的碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)減少以及菌體自身可能進(jìn)入衰亡期，使得活菌數(shù)有所下降，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降[27]。這與唐明等[28]的研究結(jié)果基本一致但略有差異，細(xì)微差異的原因可能是由于實(shí)驗(yàn)材料的個(gè)體差異造成。因此，綜合成本考慮，選擇最佳的發(fā)酵時(shí)間為36 h。

2.2.4 發(fā)酵劑添加量的確定

由圖4可知，SHI-59發(fā)酵劑添加量為0.01%～0.03%時(shí)，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，這可能是由于單位體積內(nèi)微生物數(shù)量增加過多，所需要的能量和營養(yǎng)物質(zhì)也增多，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，從而使發(fā)酵能力下降，這與姚雨杉[29]的分析結(jié)果基本一致。當(dāng)SHI-59添加量為0.025%時(shí)，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量處于較高值。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇發(fā)酵劑添加量為0.025%。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken模型，共得到17 個(gè)試驗(yàn)組，以氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值（Y），試驗(yàn)方案及結(jié)果如表3所示。

2.3.2 響應(yīng)面模型方差分析

采用Design-Expert 8.06軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析并建立回歸模型，以氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值對(duì)自變量A、B、C進(jìn)行擬合，得到二次多項(xiàng)式回歸方程為Y=0.250 00-0.004 13A+0.006 50B-0.015 00C-0.010 00AB-0.022 00AC-0.001 75BC-0.035 00A2-0.007 35B2-0.041 00C2，其中R2=0.901 6、P=0.008 4<0.01、F=7.12>4，失擬度檢驗(yàn)P=0.093 2>0.05、F=4.4，說明此模型的顯著性很高，失擬項(xiàng)不顯著，可以用來對(duì)Y（氨基酸態(tài)氮含量）進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。該方程的決定系數(shù)R2Adj=0.775 0，表明該模型中77.5%響應(yīng)值的變化由所選的自變量決定，說明該模型能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)出響應(yīng)值和各個(gè)變量之間的關(guān)系，且誤差很小。綜上所述，該模型的擬合度良好，可以用來對(duì)魚骨肉泥酶解液發(fā)酵程度進(jìn)行預(yù)測(cè)。

各個(gè)因素的F值可以反映出每個(gè)因素的重要性，F(xiàn)值越大說明對(duì)Y影響越顯著。各變量對(duì)發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量的影響程度順序?yàn)榘l(fā)酵劑添加量（C）>發(fā)酵時(shí)間（B）>發(fā)酵溫度（A），其中發(fā)酵劑添加量影響最為顯著。

2.3.3 響應(yīng)面的交互作用分析

采用Design-Expert 8.06軟件，通過固定其中某一因素，繪制Y與其他2 個(gè)因素的三維響應(yīng)曲面圖和等高線圖，從響應(yīng)面分析圖上可以形象地看出兩因素之間的相互作用，若等高線為橢圓形，則表明兩因素交互作用顯著，若為圓形則表明兩因素交互作用不顯著[30]。

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的改變和發(fā)酵劑添加量的改變，響應(yīng)曲面彎曲度變大，等高線呈橢圓形，表明發(fā)酵溫度和發(fā)酵劑添加量?jī)烧呓换プ饔脤?duì)氨基酸態(tài)氮含量影響顯著。

由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的改變，響應(yīng)曲面彎曲度變大，等高線呈橢圓形，表明發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度兩者交互作用較明顯。

由圖7可知，隨著發(fā)酵劑添加量的增加和發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，響應(yīng)曲面彎曲度變大，等高線呈橢圓形，表明發(fā)酵劑添加量和發(fā)酵時(shí)間兩者交互作用較明顯。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)最佳優(yōu)選條件：選用SHI-59發(fā)酵劑，發(fā)酵溫度34.4 ℃、接種量0.024%、發(fā)酵時(shí)間52.68 h，在此條件下發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量理論值為0.25%。為了驗(yàn)證此模型的正確性及考慮實(shí)際生產(chǎn)的工藝情況，選用發(fā)酵溫度34 ℃、接種量0.024%、發(fā)酵時(shí)間53 h，利用此最佳工藝條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。得到發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量分別為0.257%、0.262%、0.248%，其平均值為0.256%，與此模型基本相符，表明該模型具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本研究以鯰魚頭、魚排肉泥酶解液及發(fā)酵液為研究對(duì)象，以氨基酸態(tài)氮含量為考察指標(biāo)，經(jīng)過絞碎、高溫高壓處理得到高壓浸提液，100 g魚骨肉泥中加入1 200 U/g復(fù)合蛋白酶，55 ℃酶解2 h，然后再加入720 U/g風(fēng)味蛋白酶，繼續(xù)酶解1 h，滅酶后得到分步酶解液。經(jīng)分析，分步酶解液中游離氨基酸總量是高壓浸提液的6.09 倍，特別是對(duì)鮮味起重要作用的谷氨酸含量由0增加至6.67 mg/100 g，天冬氨酸、絲氨酸、蛋氨酸含量分別是高壓浸提液的3.10、82.71、8.43 倍。在分步酶解液的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，利用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)選出最佳發(fā)酵工藝條件：選用SHI-59發(fā)酵劑、接種量0.024%、發(fā)酵溫度34 ℃、發(fā)酵時(shí)間53 h。發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量理論值為0.25%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為0.256%。此結(jié)果和姚藝璇等[31]的分析結(jié)果基本一致，雙酶酶解有效降低了酶解液中的不良風(fēng)味，發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生過多有機(jī)酸，增加了氨基酸含量，也改變了感官品質(zhì)。

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收稿日期：2021-01-19

基金項(xiàng)目：天津市淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（水產(chǎn)品加工崗位）項(xiàng)目

第一作者簡(jiǎn)介：于德陽（1984—）（ORCID： 0000-0001-5083-8619），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。

E-mail： 24673750@qq.com

通信作者簡(jiǎn)介：馬儷珍（1963—）（ORCID： 0000-0003-2744-7171），女，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工原理與技術(shù)。

E-mail： Malizhen-6329@163.com