腫瘤壞死因子受體超家族成員4(TNFRSF4)敲除和人源化小鼠模型的建立

黃藝瀅白琳雷雪裴李珂雅李欣悅侯麗雅石桂英

(國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)

目前免疫檢查點(diǎn)阻滯劑在腫瘤免疫治療中受到很大關(guān)注, 靶向程序性細(xì)胞死亡蛋白 1(programmed cell death,PDCD1)和細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4,CTLA4)的治療劑的成功為癌癥治療策略提供了更多的選擇[1-2]。然而,盡管此療法在一些患者中能夠消除腫瘤并實(shí)現(xiàn)患者的長(zhǎng)期生存,但并非對(duì)所有患者都有效果[3],許多患者對(duì)基于免疫檢查點(diǎn)阻斷的單一藥物治療有抗藥性[4]。因此,具有不同作用機(jī)制或不同靶點(diǎn)的新型免疫調(diào)節(jié)藥物亟待開發(fā)[5-6]。腫瘤壞死因子受體超家族成員 4(tumor necrosis factor receptor superfamily member 4,TNFRSF4)(也稱為OX40 或 CD134)是 TNF 受體超家族的一員,在活化的T 細(xì)胞上高度表達(dá),有一個(gè)已知配體TNFSF4(也稱為OX40 L 或CD252),主要在活化的抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)[7-8]。TNFRSF4 與配體結(jié)合并激活后,T 細(xì)胞中的下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活,導(dǎo)致核因子 κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的轉(zhuǎn)錄激活[9]。目前,在早期癌癥臨床試驗(yàn)中測(cè)試了幾種anti-TNFRSF4 激動(dòng)性單克隆抗體,越來(lái)越多的臨床前證據(jù)支持其臨床發(fā)展[4]。人類和小鼠的TNFRSF4 只具有69.17%的同源性,為進(jìn)一步研究TNFRSF4 相關(guān)藥物,使用TNFRSF4 人源化小鼠是更好的選擇。

采用CRISPR/Cas9 的方法將人源TNFRSF4 基因?qū)氲叫∈蟮氖芫阎?同時(shí)敲除小鼠內(nèi)源TNFRSF4 基因的表達(dá)。TNFRSF4 人源化小鼠(TNFRSF4h/h)及TNFRSF4 敲除小鼠(TNFRSF4-/-)表型正常。通過建立基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)方式與人類相似的模型,改善TNFRSF4 在人與小鼠中種屬差異導(dǎo)致的在臨床測(cè)試與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異,從而使藥物評(píng)價(jià)的結(jié)果更加客觀。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí) C57BL/6 J(雌性,3 ～ 4 周齡,30 只,7～ 12 g;雄性,8 周齡,30 只,19 ～ 25 g)及 ICR 小鼠(雌性,8 ～ 10 周齡,8 只,25 ～ 33 g),購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2020-0004】并在本所SPF 級(jí)動(dòng)物屏障環(huán)境動(dòng)物房【SYXK(京)2019-0014】中長(zhǎng)期飼養(yǎng)繁殖。實(shí)驗(yàn)中繁殖產(chǎn)生TNFRSF4h/h和TNFRSF4-/-及其野生型小鼠,其中各10 只用于實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20 ～26℃,濕度40% ～70%,光照周期明暗比12 h:12 h。飼養(yǎng)期間小鼠自由進(jìn)食飲水,墊料、鼠盒、水瓶、均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理。涉及動(dòng)物操作程序和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本所動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):BL18003)。

1.1.2 主要試劑與儀器

載 體 構(gòu) 建: 試 劑 盒 MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit ( Ambion, Am1354 ); 試 劑 盒mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit(Ambion,Am1345);基因 型 鑒 定:EasyPure ?Genomic DNA Kit(Transgen,EE101-12);鼠尾直接PCR 試劑盒(Bimake,B45012);細(xì)胞培養(yǎng):MEM 培養(yǎng)基(Gibco,12571063)、胎牛血清(Gibco,10099141C)、青鏈霉素(Gibco,15140122)、CD3 抗體(Santa,sc-20047);RT-PCR:TRIzol(Invitrogen,15596018);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo,K1682);流式細(xì)胞術(shù):紅細(xì)胞裂解液(BD,555899);抗 體:CD4、B220、CD8、CD11b、NK1.1、CD3、TNFRSF4(Invitrogen)。

多樣品研磨珠均質(zhì)儀(OMNI,Bead Ruptor 24 Elite);電泳儀(Bio-Rad);PCR 儀(Hema);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo);流式細(xì)胞儀(BD FACSAria);組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica)。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建

小鼠TNFRSF4 基因位于第四號(hào)染色體的4E2區(qū)段(Chromosome 4: 156,013,843-156,016,612,ENSMUSG00000029075)。針對(duì)該基因,設(shè)計(jì)并合成一對(duì)向?qū)NA(single-guide RNA,sgRNA)作用靶點(diǎn)(上海英濰捷基),分別為靶點(diǎn) 1 ∶5’-CCTGTC CGCCTACTCTTCTTG-3’ (寡 核苷 酸序列 為: m-TNFRSF4-gRNA UP1 ∶5’-TAGGCAAGAAGAGTAG GCGGAC-3’ 和 m-TNFRSF4-gRNA DOWN1 ∶5’-AAACGTCCGCCTACTCTTCTTG-3’) 和靶點(diǎn) 2 ∶5’-CTTTGAGATGTAGTGGCCGGG-3’ (寡核苷酸序列為:m-TNFRSF4-gRNA UP2 ∶5’-TAGGCTTTGAGAT GTAGTGGCC-3’和 m-TNFRSF4-gRNA DOWN2 ∶5’-AAACGGCCACTACATCTCAAAG-3’)?？寺y(cè)序結(jié)果正確的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將合成的 TNFRSF4 sgRNA 單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段。用Bsa I酶切pUC57-sgRNA 表達(dá)載體使其線性化,然后與TNFRSF4 sgRNA 雙鏈進(jìn)行連接。

構(gòu)建完成的sgRNA 載體和pST1374-NLS-flaglinker-Cas9 載體分別利用試劑盒 T7 Transcription Kit 或T7 ULTRA Transcription Kit 通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA 和Cas9-RNA。

1.2.2 顯微注射

將sgRNA 與Cas9-RNA 混合,用顯微注射法注射于C57 小鼠受精卵中,用ICR 雌鼠作為假孕受體,將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部,等待小鼠出生。

1.2.3 基因型鑒定

小鼠出生后進(jìn)行編號(hào),并取尾尖進(jìn)行鑒定。使用EasyPure? Genomic DNA Kit 提取基因組 DNA,根據(jù)人源化小鼠序列信息分別設(shè)計(jì)2 對(duì)人源化及1對(duì)野生檢測(cè)引物(上海英濰捷基),2 對(duì)人源化檢測(cè)引物分別為:M-TNFRSF4-UP-S:5’-CAACACCATG CAGCTCACAACTGCC-3’, M-TNFRSF4-UP-A: 5’-TGTCCTCACAGATTGCGTCC-3’(產(chǎn)物 1451 bp)和M-TNFRSF4-DOWN-S:5’-CAGAAGTGGGAGTGAGC GG-3’,M-TNFRSF4-DOWN-A:5’-TCTGCTTGAGTT CACTTCCACTTC-3’(產(chǎn)物1696 bp),可以分別檢測(cè)轉(zhuǎn)入人源TNFRSF4 基因的上游和下游;1 對(duì)野生引物為 M-TNFRSF4-WT-S: 5’-GTTCACCACTGCCTA TAACTCTAGCTC-3 ’ 和 M-TNFRSF4-WT-A: 5 ’-CTTCATTGTAGAAGCCAGTCTCACAC-3’,檢測(cè)鼠源TNFRSF4 基因。使用2 對(duì)人源化檢測(cè)引物時(shí),人源化小鼠子代PCR 產(chǎn)物中TNFRSF4 人源基因上下游表達(dá),且大小正確,則小鼠含有該人源基因且插入位置正確,為雜合或純合小鼠,若同時(shí)使用野生引物檢測(cè)未表達(dá)鼠源TNFRSF4 基因(產(chǎn)物886 bp),則為人源化純合小鼠。

根據(jù)敲除小鼠序列信息設(shè)計(jì)1 對(duì)敲除引物為M-TNFRSF4-KO-F:5’-TGCCTGTCCGCCTACTCTTC-3’和 M-TNFRSF4-KO-R:5’-CTTTCAAACCCCTACC CTATACTTCTG-3’,檢測(cè)敲除小鼠基因型。使用敲除引物時(shí),小鼠子代PCR 產(chǎn)物中若含有1964 pb 的片段,則小鼠含有正常鼠源TNFRSF4 基因,若含有503 bp 的片段,則小鼠含有敲除后的TNFRSF4 基因,敲除小鼠子代若只含有敲除后的TNFRSF4 基因而無(wú)正常鼠源基因,則為純合敲除小鼠。

使用鼠尾直接PCR 試劑盒進(jìn)行PCR,擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 15 min;(95℃ 30 s,62℃ 30 s,72℃ 2 min)×30 循環(huán);72℃ 10 min。使用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。隨后,選取包含突變的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆,并進(jìn)行測(cè)序分析,確定DNA 缺失片段信息。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè) TNFRSF4 mRNA 在小鼠各組織中的表達(dá)

取后續(xù)繁育的雌性TNFRSF4 人源化小鼠純合(TNFRSF4h/h)(3 月齡)及其同窩野生(TNFRSF4m/m)各1 只,取心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腦、骨髓,用 TRIzol分離總RNA,并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。根據(jù)序列信息分別設(shè)計(jì) 1 對(duì)人源及 1 對(duì)小鼠源TNFRSF4 mRNA 檢測(cè)引物(上海英濰捷基),分別為hTNFRSF4-F:5’-TGGGCCTGGGGCTGAGC-3’,hTN FRSF4-R:5’-TTGTAGCTGTCCAG GGGCTGG-3’,TM為65℃,產(chǎn)物 304 個(gè)堿基對(duì);和 mTNFRSF4-F:5’-CATCCGTGTGAGACTGGCTT-3’,mTNFRSF4-R:5’-AGCTGTTTCCCCAACAAGGT-3’,TM 為 60℃,產(chǎn)物580 個(gè)堿基對(duì)。并設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)參檢測(cè)引物β-actin-F:5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’,β-actin-R:5’-TTGATGTCACGCACGATTTC-3’,TM 為 60℃,產(chǎn)物223 個(gè)堿基對(duì)。

1.2.5 HE 染色檢測(cè)淋巴細(xì)胞在各組織中的分布

選用3 月齡的TNFRSF4h/h雄性小鼠和同窩TNFRSF4m/m小鼠、2 月齡TNFRSF4-/-雄性小鼠和同窩TNFRSF4+/+小鼠各2 只,福爾馬林固定24 h 以上,取心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腦、骨髓脫水、包埋、切片,最后進(jìn)行HE 染色。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中各類細(xì)胞的比例

TNFRSF4h/h小鼠7 只和同窩TNFRSF4m/m小鼠5只,取外周血100 μL(EDTA 抗凝),使用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。每管血中加入40 μL PBS + CD4(FITC)、NK1.1(PE)、CD3(PerCP-Cy5.5)、B220(PE-Cy7)、CD8(APC)、CD11b(APC-Cy7)小鼠單克隆抗體各 0.5 μL。避光 4℃孵育 30 min,PBS 洗 3次,1500 r/min 離心 5 min,200 μL PBS 重懸,使用流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞,FlowJo 軟件計(jì)算細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性表達(dá)率。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TNFRSF4 在基因敲除小鼠脾中的表達(dá)

取TNFRSF4 敲除小鼠純合(TNFRSF4-/-)及其同窩野生型(TNFRSF4+/+)小鼠各2 只(2 月齡,雌雄各半),獲取脾細(xì)胞后用MEM 培養(yǎng)基加入10%胎牛血清和1%青鏈霉素,在37℃及5% CO2環(huán)境中培養(yǎng),并用 CD3 抗體(0.1 μg/mL)刺激培養(yǎng) 4 d。每管血中加入 40 μL PBS、CD4(FITC)、CD3(PerCPCy5.5)、TNFRSF4(PE-Cy7)、CD8(APC)小鼠單克隆抗體各 0.5 μL。避光 4℃孵育 30 min,PBS 洗 3次,1500 r/min 離心 5 min,200 μL PBS 重懸,使用流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞,FlowJo 軟件計(jì)算細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

pUC57-sgRNA 表達(dá)載體經(jīng)Bsa I 酶切線性化,合成的TNFRSF4 sgRNA 雙鏈的粘性末端與表達(dá)載體Bsa I 酶切后的粘性末端相匹配,兩者連接,成功構(gòu)建TNFRSF4 sgRNA 表達(dá)載體,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列正確。

2.2 TNFRSF4 敲除及人源化小鼠的構(gòu)建

按照實(shí)驗(yàn)方案(圖1),將轉(zhuǎn)錄后的sgRNA 和Cas9 mRNA 混合后通過顯微注射技術(shù)注射到C57小鼠受精卵中,移植到ICR 假孕鼠子宮內(nèi),第1 批出生23 只幼仔,第 2 批出生22 只幼仔,使用 PCR 進(jìn)行基因型鑒定。根據(jù)PCR 結(jié)果,選取分子量不同于野生型條帶的 PCR 產(chǎn)物測(cè)序并與野生型小鼠TNFRSF4 基因序列比較。結(jié)果顯示,第1 批小鼠中,2#,7#小鼠發(fā)生基因敲入,第2 批小鼠中,7#小鼠發(fā)生基因敲除。將F0 代小鼠與C57 小鼠進(jìn)行雜交,獲得雜合子TNFRSF4h/m或TNFRSF4+/-,將雜合子互交并將子代進(jìn)行基因型鑒定(圖2),得到純合敲入或敲除小鼠TNFRSF4h/h或TNFRSF4-/-。

2.3 TNFRSF4 敲除及人源化小鼠組織中TNFRSF4 的表達(dá)

為了鑒定人源化小鼠是否在蛋白水平發(fā)生TNFRSF4 敲除或人源化轉(zhuǎn)入,取3 月齡小鼠外周血進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定,使用種屬反應(yīng)性為小鼠的TNFRSF4 抗體檢測(cè) TNFRSF4 表達(dá)(圖3a)。結(jié)果顯示,在TNFRSF4-/-小鼠的外周血中,TNFRSF4 表達(dá)被敲除。

注:在sgRNA 和Cas9 mRNA 的參與下,小鼠TNFRSF4 第一外顯子被剪切;a:使用人TNFRSF4 的CDS 區(qū)及BGH Poly A 組成的1083 bp 閱讀框,成功替換了小鼠TNFRSF4 第一外顯子的編碼區(qū),建立TNFRSF4 人源化小鼠;b:閱讀框未能替換小鼠TNFRSF4 第一外顯子的編碼區(qū),建立TNFRSF4 敲除小鼠。圖1 TNFRSF4 人源化及敲除小鼠建立方案Note. With the participation of sgRNA and Cas9 mRNA, the first exon of mouse TNFRSF4 was cut. a. The 1083 bp reading frame composed of the CDS region of human TNFRSF4 and BGH Poly A was used to replace the coding region of the first exon of mouse TNFRSF4 to establish a humanized TNFRSF4 mouse. b. The reading frame did not replace the coding region of the first exon of mice TNFRSF4 and a TNFRSF4 knockout mice was established.Figure 1 Establishment of TNFRSF4 humanization and knockout mice

由于市售蛋白抗體無(wú)法區(qū)分人源與小鼠源TNFRSF4 蛋白,使用 RT-PCR 鑒定TNFRSF4h/h和TNFRSF4m/m小鼠各組織中 mRNA 表達(dá)(圖3b)。結(jié)果可見人特異性引物只能擴(kuò)增TNFRSF4h/h小鼠的cDNA,而小鼠特異性引物也只能擴(kuò)增TNFRSF4m/m的 cDNA,結(jié)果可見在TNFRSF4h/h小鼠中,鼠源TNFRSF4 被人源替代。

注:使用PCR 鑒定子代小鼠基因型,突變可傳代;M:Marker(TaKaRa,DL2000);H: 水;h/h:TNFRSF4 人源化純合子小鼠;h/m:TNFRSF4 人源化雜合子小鼠;m/m:同窩野生型小鼠;a:鑒定使用引物M-TNFRSF4-UP,M-TNFRSF4-DOWN; b:鑒定使用引物M-TNFRSF4-WT;c:-/-:TNFRSF4 基因敲除純合子小鼠;+/-:TNFRSF4 基因敲除雜合子小鼠;+/+:野生型小鼠;使用鑒定引物M-TNFRSF4-KO。圖2 PCR 鑒定子代小鼠基因型Note. Offspring mice were identified by PCR, the mutation can be transmitted. M.Marker(TaKaRa,DL2000). H. H2O. h/h. Humanized TNFRSF4 homozygous mouse. h/m. Humanized TNFRSF4 heterogeneous mouse. m/m. Wild-type mice. a. Identification used primers M-TNFRSF4-UP and MTNFRSF4-DOWN. b. Identification used primers M-TNFRSF4-WT. c. -/-. TNFRSF4 knock-out mice. +/-. TNFRSF4 heterogeneous mice. +/+.Wild-type mice. Identification used primers M-TNFRSF4-KO.Figure 2 Identify the genotype of the offspring mice by PCR

注:a:流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)TNFRSF4+/+和TNFRSF4-/-小鼠培養(yǎng)的脾細(xì)胞中CD3+CD4+T 細(xì)胞中TNFRSF4+細(xì)胞的直方圖;b:TNFRSF4 在TNFRSF4m/m(1～8)和 TNFRSF4h/h小鼠(9 ～ 16)心(1,9)、肝(2,10)、脾(3,11)、肺(4,12)、腎(5,13)、胸腺(6,14)、腦(7,15)、骨髓(8,16)中的表達(dá);hTNFRSF4:人特異性 TNFRSF4 引物;mTNFRSF4:小鼠特異性 TNFRSF4 引物;β-actin:小鼠特異性 β-actin 引物;M:Marker(TaKaRa,DL2000)。圖3 TNFRSF4-/-及TNFRSF4h/h小鼠中TNFRSF4 表達(dá)Note. a. Proportion of TNFRSF4+ cells in CD3+CD4+T cells of splenocytes by flow cytometry. b. Expression of TNFRSF4 in heart (1,9), liver (2,10), spleen (3,11), lung (4,12), kidney (5,13), thymus (6,14), brain (7,15) and bone marrow (8,16) of TNFRSF4m/m(1 ～8) and TNFRSF4h/h mice (9 ～ 16). hTNFRSF4. Human-specific TNFRSF4 primer. mTNFRSF4. Mouse-specific TNFRSF4 primer. β-actin. Mouse-specific β-actin primer. M. Marker (TaKaRa, DL2000).Figure 3 TNFRSF4 expression in TNFRSF4-/- and TNFRSF4h/h mice

2.4 人源 TNFRSF4 基因可正常替代小鼠TNFRSF4 基因

HE 染色結(jié)果顯示,在TNFRSF4-/-小鼠及TNFRSF4h/h小鼠的各組織中,沒有觀察到淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖4),且全身病理檢查未發(fā)現(xiàn)異常。結(jié)果表明,TNFRSF4h/h及TNFRSF4-/-小鼠發(fā)育正常,在6 個(gè)月內(nèi)沒有觀察到自身免疫性疾病發(fā)展的跡象。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了TNFRSF4h/h小鼠外周血中各類細(xì)胞的比例,發(fā)現(xiàn)其外周血中B 細(xì)胞(B220+)、T 細(xì)胞(CD3+、 CD4+、 CD8+)、 粒 細(xì) 胞 (CD11b+) 和 NK(NK1.1+)細(xì)胞的比例都沒有明顯差異(圖5)。結(jié)果說(shuō)明人源化TNFRSF4 基因后沒有改變正常生理狀態(tài)下小鼠免疫系統(tǒng)的組成。因此,在TNFRSF4h/h小鼠中,人源TNFRSF4 等位基因可以替代小鼠TNFRSF4基因。

注:m/m:野生型小鼠;h/h:TNFRSF4 人源化純合子小鼠;+/+:野生型小鼠;-/-:TNFRSF4 基因敲除純合子小鼠。圖4 組織HE 染色Note. m/m. Wild-type mice. h/h. Humanized TNFRSF4 mice. +/+. Wild-type mice. -/-. TNFRSF4 knockout mice.Figure 4 Tissue HE staining

注:a:流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)不同免疫細(xì)胞在外周血中的比例;b ～e:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中B220(b),CD3(c),CD11b(d),NK1.1(e)表達(dá)。圖5 在TNFRSF4h/h小鼠外周血中不同免疫細(xì)胞的比例Note. a. Proportion of different immune cells in peripheral blood by flow cytometry. b～e. Expression of B220(b), CD3(c), CD11b(d), NK1.1(e) in peripheral blood by flow cytometry.Figure 5 Proportion of different immune cells in peripheral blood of TNFRSF4h/h mice

3 討論

TNFRSF4 最初被鑒定為 T 細(xì)胞活化標(biāo)志物[10],在之后的研究中發(fā)現(xiàn)它是具有共刺激功能的NGFR/TNFR 超家族成員[11-14]。TNFRSF4 可以在活化的CD4+和CD8+T 細(xì)胞上表達(dá),但是在靜止的初始T 細(xì)胞或大多數(shù)靜止的記憶T 細(xì)胞上都沒有發(fā)現(xiàn)[10-12]。盡管長(zhǎng)期以來(lái)人們一直認(rèn)為TNFRSF4表達(dá)僅限于活化的常規(guī)T 細(xì)胞,但現(xiàn)在已經(jīng)在活化的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞[15],NK 細(xì)胞[16-17],NKT 細(xì)胞[18-19]和嗜中性粒細(xì)胞[20]上發(fā)現(xiàn)了它。

TNFRSF4 敲除小鼠在正常情況下無(wú)明顯病理反應(yīng),研究表明,TNFRSF4 敲除小鼠免疫后產(chǎn)生的初始效應(yīng)CD4+T 細(xì)胞要更少,并且對(duì)TNFRSF4 基因敲除動(dòng)物或缺乏TNFRSF4 的CD4+T 細(xì)胞的研究進(jìn)一步闡明了,TNFRSF4-TNFSF4 的相互作用在初始T 細(xì)胞的有效克隆擴(kuò)增和產(chǎn)生有效的初始CD4+T 細(xì)胞應(yīng)答中起了重要作用[21-24]。

抗 CTLA4 抗體 ipilimumab(Yervoy?)在 2011 年獲得批準(zhǔn),通過顯著提高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的長(zhǎng)期生存率,改變了免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域。從那時(shí)起,許多其他免疫腫瘤學(xué)藥物已進(jìn)入臨床開發(fā)。除了檢查點(diǎn)抑制劑外,這些還包括共刺激分子,例如TNFRSF4 和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的 TNFR 相關(guān)蛋白等[2,25-26]。然而,由于T 細(xì)胞的系統(tǒng)性活化,CTLA4阻斷抗體與嚴(yán)重的免疫相關(guān)不良事件有關(guān),這限制了它們的使用[27-28]。與 CTLA4 相似,在腫瘤微環(huán)境中,TNFRSF4 在活化的 T 細(xì)胞上表達(dá)高度上調(diào)[29-31]。目前,幾種抗TNFRSF4 單克隆抗體正在作為單一療法或與檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)用進(jìn)行臨床開發(fā)[32-34]。有文獻(xiàn)表明,將檢查點(diǎn)抑制劑與T 細(xì)胞共刺激性激動(dòng)抗體組合可以通過增強(qiáng)T 細(xì)胞擴(kuò)增和效應(yīng)子功能,同時(shí)控制Tregs 的抑制功能,將冷腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮[瘤[35-36]。與單特異性抗體相比,通過靶向在腫瘤中過度表達(dá)的兩個(gè)受體,有可能增加對(duì)腫瘤區(qū)域的定位,并且降低全身性T 細(xì)胞活化的風(fēng)險(xiǎn)并提高療效。由于人類和小鼠的TNFRSF4 只具有約70%的同源性,為進(jìn)一步研究 TNFRSF4 相關(guān)藥物,使用TNFRSF4 人源化小鼠可以更好的與臨床接軌。TNFRSF4 基因人源化小鼠的免疫應(yīng)答是在自然環(huán)境中產(chǎn)生的,可以用于評(píng)估與潛在人類治療性抗體相關(guān)的自身免疫副作用的能力。

因此,本研究建立的TNFRSF4 人源化小鼠模型可以改善TNFRSF4 在人與小鼠中種屬差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異,從而使藥物評(píng)價(jià)的結(jié)果更加客觀,為治療性抗體的驗(yàn)證提供了更有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。同時(shí),建立的TNFRSF4 敲除小鼠為TNFRSF4在免疫過程中的作用機(jī)制研究提供了小鼠模型。