藥物結晶中的經典與非經典結晶路徑

宋舒虹，姚昌林，王 蕾，曲亞倩，陶緒堂

(山東大學，晶體材料研究所，晶體材料國家重點實驗室，濟南 250100)

0 引 言

結晶在地球化學、生物及合成材料中占據(jù)核心地位，長期以來一直受到研究人員的廣泛關注，如在化學、制藥和食品工業(yè)，結晶實現(xiàn)了對產品的造粒與提純。尤其在制藥領域，超過70%的藥物都是以固體形式存在的[1]，包含了多晶型、水合物、鹽和溶劑化物，除此之外，目前一些藥物的非晶態(tài)形式也得到了廣泛應用。結晶作為一個極其重要的步驟，深刻影響著藥物的上、下游加工工藝，其中藥物晶型是影響固體藥物質量和療效的重要因素。藥物晶型不同使得藥物的溶解度、溶出速率、穩(wěn)定性等理化指標有很大差異，直接影響到藥物的生物利用度、安全性和療效。因此藥物晶型研究是目前科學界及制藥工業(yè)界的重要研究內容和世界性前沿課題[2]。然而，目前晶型調控存在各種問題，如晶型有時會突然“消失”，即晶型調控重復性、可控性差的問題，晶型失控現(xiàn)象給企業(yè)帶來嚴重后果，使產品研發(fā)遲滯、商業(yè)生產中斷。1998年，美國雅培公司的HIV蛋白酯酶抑制劑上市兩年后，發(fā)現(xiàn)相同的制劑工藝下，原料藥晶型“消失”，轉晶成了溶解度更小的更穩(wěn)定晶型，最終導致已經上市的藥品撤出市場，損失達上億美元[3]。“伴隨結晶”也是晶型調控中常見的現(xiàn)象，它會影響晶型的純度，增加晶型調控的難度[4]。究其原因，是對晶型的成核和生長過程研究不足，對晶體成核和生長途徑及機理不清楚，不能準確實施控制。因此加強藥物晶體的成核和生長路徑研究，了解結晶過程的前驅體相，對于調控藥物分子晶型，實現(xiàn)晶型的主動調控有重要理論指導意義[5]。

經典成核理論[6-8](classical nucleation theory, CNT)認為：結晶過程中存在一個臨界晶核尺寸，超過該尺寸，晶核通過單體的依次添加實現(xiàn)生長，最終形成結構有序的晶體。然而，越來越多的實驗現(xiàn)象表明，在一些物質的結晶過程中，單體首先轉變?yōu)榈途畚?、復合物、富溶質液滴、納米晶粒等中間態(tài)[9-11]，以該前驅體作為生長單元實現(xiàn)晶體的生長，研究人員將該過程歸結為非經典的結晶路徑(non-classical crystallization, NCC)。在藥物結晶領域，不同晶型藥物結晶的中間過程是怎樣的？是否存在中間體？中間體如何繼續(xù)長大并進一步發(fā)展成為晶體？以上均是目前藥物結晶機理研究的重要內容，也是難點所在。

1 溶液中的經典結晶路徑

CNT認為，結晶是一個由分子團簇到晶核再到晶體的變化過程，而晶核是結晶前期溶液中的分子通過自組裝形成的一種有序聚集體，藥物的晶型是由成核過程所決定的。成核與化學反應不同，有序聚集態(tài)的存在與否取決于它們的尺寸，晶核產生時需要消耗一定的自由能來形成新的界面，可利用的自由能取決于過飽和度。因此在過飽和溶液中，將分布一些穩(wěn)定的聚集態(tài)，根據(jù)所采用的過飽和度將存在一個臨界尺寸，超過這個尺寸，聚集態(tài)繼續(xù)長大，低于該臨界尺寸則處于不穩(wěn)定狀態(tài)。過飽和度越高，臨界尺寸越小，越容易成核，產生的晶體數(shù)量也越多[12]。

1.1 基于CNT的成核熱力學和動力學

1897年，奧斯特瓦爾德提出了著名的奧斯特瓦爾德階段定律(Ostwald’s law of stages)[13]，指出結晶過程中首先出現(xiàn)的是最不穩(wěn)定晶型，隨后出現(xiàn)穩(wěn)定性依次提高的其他晶型，不同晶型出現(xiàn)的先后順序與它們自身的穩(wěn)定性有關。奧斯特瓦爾德階段定律是在藥物結晶實驗中常用的指導原則, 是經過一系列實驗數(shù)據(jù)總結得到的一個基本規(guī)律，是對晶型成核難易程度的基本判斷依據(jù)。然而這個規(guī)則并不一直有效。例如CaCO3各個晶型在模擬體液中的轉化并不符合奧斯特瓦爾德階段定律[14]。對乙酰氨基酚從水中結晶得到的是穩(wěn)定晶型I[15]。奧斯特瓦爾德時期，由于飽和溶液或者熔體中存在亞穩(wěn)區(qū)間或過冷現(xiàn)象，即熱滯后現(xiàn)象，人們由此推斷成核存在勢壘。直到Volmer和Gibbs等闡明了決定成核過程的參數(shù)，進一步發(fā)展了成核動力學過程理論，成核勢壘才真正被人們理解[16-17]，即CNT。

CNT是目前唯一可用于解釋晶體成核過程的比較成熟的理論，并在后續(xù)發(fā)展中不斷得到完善[18]，該理論指出，晶體的成核速率J可簡單地表達為：

(1)

式中：J為晶體成核速率，即單位時間內單位體積過飽和溶液中產生晶體的數(shù)量；S為過飽和度，是評價過飽和體系脫離平衡態(tài)程度的指標；A、B為常數(shù)，根據(jù)B/ln2S=W/kT又定義了成核功，即成核勢壘。

由成核速率表達式可知，由于存在成核勢壘，因此溶液結晶中通常存在一個亞穩(wěn)濃度區(qū)間，在該區(qū)間內，盡管溶液過飽和，自發(fā)成核可以近似忽略，超過該區(qū)間，過飽和體系是不穩(wěn)定的。這也從熱力學上解釋了實際實驗中觀察到成核延遲發(fā)生的動力學現(xiàn)象。另外，Mullin等[19]還提出了“生長死區(qū)(growth dead zone)”的概念，通常出現(xiàn)在較低的過飽和度下，在該區(qū)間內晶體不生長，該區(qū)間的存在首先阻止了體系向平衡態(tài)的過渡，降低了產率，其次在多晶型體系下，該區(qū)間內可能存在一個長期存在的亞穩(wěn)相，誘導其他晶型的成核與生長。對于澄清溶液中的均相成核，公式(2)定義了成核的熱力學參數(shù)B，而非均相成核中，界面能γ應替換為有效界面能γHEN=ψ·γ，從而得到式(3)。對于活性模板，活化因子ψ的值在0～1之間，使B值減小，從而降低了成核勢壘。

(2)

(3)

式中：c為形狀因子；v為晶體中的分子體積；γ為界面能；k為玻爾茲曼常數(shù)；T為溫度。

界面能γ受晶核內的分子排列及溶液與晶面表面之間相互作用的影響，因此也可以說熱力學參數(shù)B包含了成核過程中有關分子水平的信息。CNT將晶核的界面能等同于與同一溶液接觸的無限大表面的界面能。通常在分子晶體的成核中，一種結晶化合物的界面能是各向異性的，這也就意味著一個合理的界面能應該是晶核所有表面的加權平均值。Roberts等[20]通過計算阿司匹林晶體界面能，與結晶習性的變化相結合，說明在乙醇水溶液中，隨著晶體疏水表面比例的增加，有效界面能從6 mJ/m2到42 mJ/m2不等，這也反映了式(2)和(3)中形狀因子c和界面能γ是相互依存的關系，缺少其中任何一個都難以獲取另一參數(shù)的有效信息。

從動力學的角度來講，溶液中的團簇自組裝之前，生長單元必須首先由一個溶解、溶劑化的狀態(tài)過渡到一個部分去溶劑化、吸附在晶核表面的狀態(tài)，擴散過程需要跨越能壘，跨越該能壘需要的活化能與去溶劑化和分子的構象改變有關。式(1)中指前因子A可表達為：

A=zf*C0

(4)

式中：z為Zeldovich因子；f*為分子粘附率；C0為成核點濃度。

根據(jù)實驗所得成核速率J隨過飽和度S的變化曲線，可以得到相應的A值并估計f*C0，但由于除了在一些特殊情況下之外，成核點濃度C0難以確定，因此f*C0是所能獲得的有關分子動力學的最有效信息，f*C0可用來推斷在不同溶劑中成核分子的相對吸附速率，分子的吸附過程通常與溶液中生長單元的濃度呈線性關系，因此也常用f*C0/M的值來評估不同溶劑中的分子聚集態(tài)對成核速率的影響[21]，其中M為溶液物質的質量濃度。

Bernstein等提出多晶型體系中，各種晶型是獨立的均相成核體系，某種晶型成核和生長是在幾種晶型熱力學和動力學作用下相互競爭的結果[22-23]。天津科技大學沙作良課題組研究了孕二烯酮在乙醇溶液中的結晶熱力學和結晶動力學，得出結論：在低過飽和度下，結晶熱力學和動力學都有利于形成穩(wěn)定晶型，然而在較高過飽和度下，熱力學和動力學之間會達到平衡，從而導致產生伴隨結晶現(xiàn)象[24]。龔俊波課題組對尿素在水溶液中的成核動力學進行研究，探索了化學勢和成核溫度對成核速率的影響，雖然化學勢差是結晶的驅動力，但它并不總是有利于成核過程。他們證明了當化學勢差隨成核溫度的降低而增大時，動力學因素起主導作用，使成核速率增大；然而，當化學勢差隨成核溫度的升高而減小，在動力學和熱力學方面，提高成核溫度都有利于成核過程[25]。

1.2 從溶液化學角度理解成核

CNT得出，在溶液中分子團簇克服能量勢壘成核和長大。然而，從這種動力學分析，很難得到關于團簇的組成或分子堆積的相關信息。分子在溶液中自組裝產生成核前驅體，該前驅體可以直接作為晶體的生長單元，或者經過重排附著到生長團簇上實現(xiàn)成核與生長。Cruz-Cabeza和Davey從溶液化學的角度，結合熱力學分析、晶體結構與計算模擬，得到晶核與溶液中生長單元、結構合成子之間的關系，并提出了“成核過渡態(tài)”的概念[12]。CNT與非經典成核理論中均未解決晶核中分子堆積方式即晶核結構是什么這一問題[26-27]。

為了從分子水平上理解成核過程，人們結合不同分子可能存在的自組裝模式和溶劑化形式開展了大量研究，從溶液化學的角度表征了溶液中分子的存在形態(tài)，并與成核過程建立聯(lián)系。如糖精的晶體結構中存在氫鍵二聚體[12]，如圖1所示，對其在不同溶劑中的分析發(fā)現(xiàn)，丙酮中分子的主要存在形式為溶劑化的單體，而在乙醇中分子的主要存在形式為溶劑化的單體和二聚體。在丙酮溶液中，成核過程由于涉及單體的堆積錯誤，最終得到的是孿晶，而在乙醇溶液中，成核過程與二聚體的有序排列有關，得到的是單晶[28]。在甲苯中，2,6-二羥基苯甲酸的存在形態(tài)為中心對稱的羧酸二聚體，結晶實驗中得到的是晶型1[29]，而在氯仿中為不具有對稱中心的四聚體結構，得到的是晶型2[30]，如圖2所示。結晶實驗與溶液化學的對應結果表明：成核與溶液中分子的自組裝過程有關。

圖1 糖精晶體結構中的氫鍵二聚體[12]Fig.1 Hydrogen bonded saccharin dimer extracted from its crystal structure[12]

圖2 2,6-二羥基苯甲酸的兩種晶型[12]Fig.2 Two polymorphic forms of 2,6-dihydroxybenzoic acid[12]

圖3 兩種自組裝模式下的溶質-溶質分子對(a)氫鍵相互作用和(b)芳環(huán)堆積作用[31]Fig.3 Solute-solute pairs in two self-assembly modes:(a) hydrogen-bonding; (b) aromatic stacking[31]

Cruz-Cabeza和Davey研究了芳香族羧酸苯甲酸(BA)、對甲基苯甲酸(pTA)、對氨基苯甲酸(pABA)和對硝基苯甲酸(pNBA)等分子在不同溶劑中的成核動力學。他們從物理化學的角度，首次考察了分子結構、晶體結構與成核動力學的關系。溶液中這些分子的自組裝模式有兩種：一種為氫鍵二聚體(hydrogen-bonded dimers, HBD)；另一種為通過芳環(huán)堆積作用形成二聚體(stacked dimers, SD)，由于芳環(huán)上具有不同取代基，且取代基的分子形狀不同，由此導致芳環(huán)堆積基元的幾何排列與重疊程度不同。圖3所示為兩種自組裝模式下分子的幾何形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)相對成核速率并不只是由單體吸附決定，還與對溶劑有依賴作用的芳環(huán)堆積相互作用力有關。即晶體的成核速率是由團簇的生長速率所決定的，而團簇的生長是單體分子通過芳環(huán)堆積作用附著到晶核表面實現(xiàn)的。芳環(huán)堆積作用是成核中的關鍵步驟[31]。

他們還研究了對氨基苯甲酸(pABA)不同晶型的成核動力學，揭示這兩種不同晶型的成核路徑以及成核過程溶液中團簇的分子堆積方式和組成。α-pABA中通過氫鍵相互作用形成了羧酸二聚體，它們沿b軸以平移方式無限堆積，實現(xiàn)了該晶型沿b軸的生長，β-pABA中通過COOH…NH2相互作用形成了層內四聚體結構單元[32]，而分子堆積是通過層間形成的二聚體以中心對稱方式實現(xiàn)的[33]，如圖4所示。成核時分子通過芳環(huán)堆積作用自組裝形成二聚體，在大部分溶劑和過飽和環(huán)境下，二聚體中的分子是以平行方式排列的，這種排列方式在幾何上有利于后續(xù)的分子堆積，即通過酸與酸之間的相互作用形成α晶型。而在特定條件下，如低過飽和度或水溶液中，當二聚體中的分子以反演方式排列時，不同的二聚體之間通過COOH…NH2作用連接形成β晶型，或者在另一種情況下，這種以反演方式堆積形成的二聚體經過重排形成α晶型，圖5所示為pABA分子在不同的自組裝模式下結晶得到α和β晶型。在這里，水并非提供了溶液介導晶型轉變的途徑，而是由于pABA和水之間的界面張力較高，使得在某一區(qū)間內不發(fā)生晶體的成核與生長，α團簇不繼續(xù)長大，從而為β晶型的出現(xiàn)提供了充足的時間[21,34]。

圖4 β-pABA中的分子排列方式[33]Fig.4 β-pABA motifs[33]

圖5 pABA的α和β晶型溶液結晶中可能存在的自組裝路徑[33]Fig.5 Plausible self-assembly pathways in solution crystallization of α and β of pABA[33]

Davey等通過改變溶劑與過飽和度，對大量實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，由成核誘導時間得到晶體的成核速率[35]。晶體的相對生長速率越快，達到同等成核速率所需過飽和度的值就越低，說明溶液中由分子到超分子團簇的成核過程，速率限制步驟為團簇生長到臨界晶核尺寸[31]。以苯甲酸/甲苯體系為例[35]，實驗得到的成核速率與過飽和度的關系滿足CNT，并利用數(shù)值擬合得到成核參數(shù)，在分子水平解釋了芳香族羧酸在不同溶劑中的成核。

圖6 TA晶型Ⅰ的扭轉構象和晶型Ⅱ的平面構象[37]Fig.6 Twisted-like and planar-like conformations found in forms Ⅰ and Ⅱ TA[37]

人們還探究了溶液中分子的存在形式對最終生長單元所采取的構象(晶型)是否有影響。以構象多晶型藥物托芬那酸(TA)為例，此前Mattei和Li等[36]的研究表明：過飽和度影響TA的分子存在形式，從而影響其晶型。當溶質濃度提高，二聚體數(shù)量增多，二聚體中的分子構象與晶型I的扭轉構象相同(見圖6)，從而高過飽和度促進晶型Ⅰ的形成。而Davey等[37]研究發(fā)現(xiàn)，TA在甲苯溶液中分子的主要存在形式為HBD，根據(jù)Mattei和Li的計算結果，該條件下結晶所得到的應為晶型Ⅰ，而Davey等在同等條件下還得到了TA晶型Ⅱ，說明溶液中分子的存在形式與構象多晶型之間無必然聯(lián)系，無論分子在溶液中的存在形式為單體或二聚體，最終分子組裝成臨界晶核所采取的構象不受影響。要想在溶液化學與晶型選擇性之間建立聯(lián)系，應對高過飽和度下亞穩(wěn)晶型的出現(xiàn)做出解釋。乙水楊胺分子在溶液中以一種能量較高的構象存在，這種高能量構象在溶液中的濃度較低，然而在目前得到的乙水楊胺晶體中，乙水楊胺分子并非直接采用這種低濃度的高能量構象，這與分子重排并接觸到晶體表面這一過程有關[38]。

溶液中溶劑對溶質分子的溶劑化作用會降低溶質的聚集程度，去溶劑化是形成分子團簇的重要一步。苯甲酸在固態(tài)下或在非極性溶劑中都可以形成二聚體結構[39]，根據(jù)能量計算[21](見表1)，苯甲酸在三種溶劑中二聚體的形成傾向由高到低：乙腈>乙酸乙酯>異丙醇，相應的去溶劑化能力也呈現(xiàn)出同樣的規(guī)律。以苯甲酸-甲苯體系為例，圖7(d)為苯甲酸在甲苯中形成的二聚體結構，該二聚體通過與甲苯之間的π-π相互作用被溶劑化，與pABA相比，由于苯甲酸的甲苯溶液中本來就存在二聚體，成核過程不需要首先經歷分子的去溶劑化(見圖8)，因此成核速率更快，在不同溶劑中，pABA的成核速率也隨去溶劑化能力呈現(xiàn)相應的變化規(guī)律。

表1 pABA在三種溶劑中羧酸二聚體和單體的溶劑化自由能(293 K, 101.325 kPa)[21]Table 1 Solvation free energies of carboxylic acid dimer and two distinct monomers of pABA in three solvents, at 293 K and 101.325 kPa[21]

圖7 pABA在(a)異丙醇、(b)乙腈、(c)乙酸乙酯中的溶劑化形式和(d)苯甲酸在甲苯中的溶劑化形式[21]Fig.7 Solvation interactions in solution of pABA in(a) 2-propanol, (b) acetonitrile, (c) ethyl acetate and(d) benzoic acid in toluene[21]

圖8 自組裝二聚體和溶劑化單體的成核路徑[21]Fig.8 Nucleation pathways of self-assembled dimers andsolvated monomers[21]

2 熔體中的經典結晶路徑

大部分藥物的結晶都是通過溶液結晶實現(xiàn)的，而很少采用熔融結晶。熔融結晶作為一種單一組分體系簡化了影響結晶過程的因素，與溶液結晶相比，熔融結晶中無溶劑-溶質相互作用和溶液介導晶型轉變。另外，越來越多文獻報道，一些難以通過傳統(tǒng)的溶液結晶方法得到的晶型，可以在熔融結晶中成功獲得，如灰黃霉素(GSF)晶型Ⅱ[40]、ROY晶型Y04[41]、吡羅昔康晶型Ⅵ和Ⅶ[42]。通過熔融結晶篩選得到的新晶型往往比溶液法篩選的晶型具有更高自由能。在固體口服劑型中無定形藥物已受到越來越多的關注，因為無定形固體通常可以提高溶解性、溶解速率和低溶性藥物的生物利用度。然而，隨著時間的推移，高自由能非晶態(tài)藥物會有再結晶的風險，從而導致治療效果的喪失。因此，保持無定形藥物的物理穩(wěn)定性對于開發(fā)藥物配方至關重要。研究無定形藥物(熔融)結晶過程具有重要意義。熔融結晶包括晶體的成核和生長，相關研究表明，熔體中的晶體成核速率最大值所對應的溫度要低于生長速率最大值所對應的溫度，意味著二者有著不同的動力學，需要分開研究。

2.1 熔體中的晶體成核動力學

有機分子熔融結晶的成核動力學報道較少。最近，Yu課題組測量了多元醇(D-山梨醇、D-阿糖醇、D-木糖醇和甘油)[43]在熔體中的成核速率，發(fā)現(xiàn)雖然它們結構相似，但是成核速率卻相差近10個數(shù)量級。這些多元醇的成核速率可以通過CNT擬合出來，說明它們成核過程符合經典的成核理論。根據(jù)CNT[44-46]，熔融狀態(tài)下的晶體成核速率可表示為：

J=kJexp(-WC/kT)

(5)

(6)

式中：WC為成核的熱力學勢壘；σ為晶核與熔體界面自由能，需要指出的是，界面能σ微小差別就可以導致成核速率數(shù)量級差別，因此，在利用CNT解釋晶體的成核過程時，應盡可能得到成核界面能σ的準確值；ΔGV為晶體與熔體自由能之差；kJ為動力學因子，表示分子與晶核結合的頻率，可以表示為一些熔體動力學參數(shù)的函數(shù)，如式(7)～(9)所示。

kJ=fDD

(7)

kJ=fη/η

(8)

kJ=fτ/τα

(9)

式中：D為擴散系數(shù)；η為黏度；τα為結構弛豫時間；fD，fη，fτ均為溫度敏感性常數(shù)。

Yu課題組發(fā)現(xiàn)，用晶體的生長速率u可更加簡單且準確地計算出成核動力學因子[43]：

kJ=fuu

(10)

式中：fu為溫度敏感性常數(shù)。

最近，Cai課題組研究了三種聚合物(HPMCAS、PVP、PEO)對氟康唑無定形成核速率的影響[47]，發(fā)現(xiàn)HPMCAS能夠明顯抑制氟康唑無定形成核速率，PVP對其成核速率影響不大，而PEO則能明顯加快其成核速率。該研究為如何選擇穩(wěn)定無定形聚合物提供了指導。

熔融結晶過程中可能會發(fā)生交叉成核現(xiàn)象，Yu課題組提出了一種新的成核機理：交叉成核(cross nucleation)[48-49]，即最先成核的晶型(A)不會消耗完所有溶質或發(fā)生晶型轉變，而是作為模板使另一種晶型(B)成核，相較于原始晶型(A)，新晶型(B)的熱力學穩(wěn)定性可能更高也可能更低，生長速率大于等于原始晶型(A)。交叉成核與溶液介導相變中的二次成核有一定聯(lián)系但又存在差異[50-52]：相同的是，二者都是界面成核；不同的是，溶液介導相變中，二次成核的晶型一定比初始晶型有更高的熱力學穩(wěn)定性。需要指出的是，交叉成核并非晶型轉變，D-甘露醇的α晶型在δ晶型上交叉成核證實了這一點[52]：(1)盡管δ晶型的穩(wěn)定性低于α晶型，但在實驗條件下δ晶型有足夠的穩(wěn)定性，并且實驗過程中該晶型仍然在生長；(2)晶型轉變速率應隨溫度的升高而加快，但α晶型在δ晶型上出現(xiàn)的速率隨溫度升高而減慢，并且實驗中觀察到α晶型也可以在D-甘露醇的最穩(wěn)定晶型β上成核。

2.2 熔體中的晶體生長動力學

在熔點附近，晶體生長速率是由熱力學控制，溫度降低，熱力學驅動力增加，晶體生長速率加快；進一步降溫，晶體生長速率由分子擴散限制，擴散速率隨溫度降低而減慢，最終導致生長速率減慢；當溫度降低至Tg附近，生長速率異常加快，比分子擴散模式下的生長速率高出幾個數(shù)量級，這種新的晶體生長模型被稱為“玻璃態(tài)-晶體生長模型(glass-crystal growth mode)”，簡稱為GC生長模型，這種快速生長模式不僅僅出現(xiàn)在Tg以下，在溫度上升至1.15Tg時的熔融態(tài)下仍存在[53-55]。一些理論認為，GC生長模型可歸因于均相成核[56]、張力誘發(fā)分子遷移[57]、由局部分子遷移引發(fā)的固態(tài)相變[53]等。對于儲存溫度在Tg以下的無定形藥物，研究GC生長模型對其穩(wěn)定性研究具有重要意義。

熔體中的晶體生長另外一個重要特征是熔體表面的晶體生長速率要遠大于熔體內部的晶體生長速率，這是因為熔體表面分子遷移率要遠高于熔體內部的分子遷移率，如熔融態(tài)的硝苯地平[58]和灰黃霉素[59]的晶體表面生長速率均遠高于內部。上文提到，一些有機小分子在Tg附近具有GC生長現(xiàn)象，雖然GC生長是一個內部過程，但它可能與表面分子遷移率存在一定關系，這是因為晶體本身的密度高于玻璃態(tài)，晶體生長過程中的最前端會不斷產生微裂紋(自由表面)，使分子有了較高的遷移速率而加快生長速率。對于不同體系來說，表面擴散速率存在較大差異，造成這種差異主要有兩方面原因：一方面是分子尺寸，即表面分子擴散速率隨分子尺寸增大而減慢；另一方面是分子間氫鍵，即表面分子擴散速率隨分子間氫鍵增多而減慢。例如，灰黃霉素僅有氫鍵受體而無氫鍵給體，因此其晶體結構中沒有分子間氫鍵，該體系下表面分子擴散速率不受氫鍵影響，并符合“無分子間氫鍵”的無定形分子表面擴散速率的總體趨勢，即表面擴散速率隨分子尺寸的增大而減慢。為了解決無定形藥物表面分子遷移率較高使藥物穩(wěn)定性降低的問題，目前常采用納米包覆的方法提高穩(wěn)定性，如將無定形吲哚美辛用聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)[60]、明膠[61]或殼聚糖[62]包覆后，其穩(wěn)定性明顯改善。另外也可采用引入聚合物添加劑抑制無定形藥物的成核與生長過程，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的加入提高無定形D-山梨醇和D-阿糖醇的穩(wěn)定性[63]。

3 溶液中的非經典結晶路徑

隨著對成核研究的深入，由于CNT模型過于簡化，它的不足之處也被人們發(fā)現(xiàn)。在蛋白質結晶的成核動力學研究中，Vekilov課題組發(fā)現(xiàn)，實驗中測得的成核速率比根據(jù)CNT的預測值要低十個甚至十幾個數(shù)量級[64-65]，他們通過動態(tài)光散射技術，證明在過飽和溶液中，會先形成蛋白質分子的致密無序團簇，隨后從該致密無序團簇中形成晶核，并提出了兩步成核機理[66]。Myerson課題組用近紅外激光對甘氨酸溶液進行輻照，采用線偏振和圓偏振能分別得到甘氨酸的不同晶型(γ和α)，這個結果可以證實甘氨酸的兩步成核機理，即分子聚集形成晶核前會經歷一個高密度中間態(tài)[67]。后來他們利用小角X射線散射(SAXS)證實了甘氨酸的兩步成核過程，即單分子—二聚體—晶核這一成核路徑[68]。近十幾年，一系列原位表征技術的崛起(冷凍電鏡、原位透射電鏡、原位原子力顯微鏡)使在分子以及納米尺度直接觀察成核過程成為可能[69-71]。根據(jù)實驗觀察，除了經典成核路徑，經歷多核團簇、亞穩(wěn)晶態(tài)、無定形或致密液態(tài)等中間態(tài)的多步成核路徑被提出[9-11]，即非經典成核路徑(non-classical nucleation pathway)。研究者們利用原位表征技術不僅僅對蛋白質晶體的成核與生長，對生物礦化[72-73]、硅沸石[74]、無機納米材料[75-76]和有機晶體[77-78]等材料的成核和生長過程也進行了原位觀測，并對其非經典結晶路徑進行報道。

與經典結晶路徑不同，非經典結晶中采用的生長單元不再是原子、離子或分子，而是更大的前驅體粒子[9,79]，涉及成核前團簇(pre-nucleation cluster, PNC)的形成和兩步成核機理[11]。De Yoreo提出非經典的晶體生長機制中存在粒子在特定晶面上的定向附著(oriented attachment, OA)，OA使一些納米晶粒、低結晶度的納米晶粒生長為單晶[9]，另外，最近的研究表明，OA還促成了一種重要的孿晶結構——五重孿晶的形成[80]，這種OA所導致的晶體生長受粒子間界面力的影響[81-82]。許多物質都采用了非經典的結晶路徑，如蛋白質的結晶經歷了由凝聚態(tài)液相到有序晶體轉變的過程[64-66,83]，碳酸鈣的成核也與溶液中成核前團簇的形成有關[72,84-86]。藥物結晶中前驅體的存在會影響最終產物的晶型，無論前驅體為非晶態(tài)或晶態(tài)，或由短暫存在的亞穩(wěn)態(tài)組成，對其識別并進一步表征將反映最終穩(wěn)定存在晶體的有效信息，對于多晶型體系來說尤其重要。

Myerson課題組研究發(fā)現(xiàn)激光可以誘導甘氨酸過飽和溶液的成核，并達到較快的成核速率[87]，用同樣的方法，電子束與溶劑相互作用產生化學輻射可誘導氟芬那酸(FFA)的成核[88]。FFA的結晶溶液中存在3 nm和8 nm的粒子，其中不同數(shù)量的8 nm粒子會聚集到一起形成新的凝聚態(tài)團簇，根據(jù)聚集程度的不同將這些凝聚態(tài)團簇劃分為三個類別，而之所以認為這些小顆粒是非經典成核中的PNCs，是因為他們導致了新的亞穩(wěn)相的形成。如圖9所示，F(xiàn)FA非經典結晶的中間過程可總結為以下兩點:(1)PNCs聚集到一起，界面消失，結合成亞穩(wěn)的高密度液相凝聚態(tài)(dense liquid phase, DLP)，如圖10所示;(2)凝聚態(tài)的密度提高，趨向于晶態(tài)，并不斷吸收周圍溶質，相對于亞穩(wěn)態(tài)前驅體密度提高，如圖11所示。其中PNCs是結構有序的結晶態(tài)，因此在溶液中可以穩(wěn)定存在。

圖9 FFA非經典結晶過程：聚集、凝結、致密中間體的成核、結晶[88]Fig.9 Nonclassical crystallization process of FFA: aggregation, coalescence, nucleus formation from the densifiedintermediate material and crystallization[88]

圖10 PNCs隨時間變化的聚集形態(tài)，伴隨著界面的消失，PNCs聚集形成一個連續(xù)的凝聚態(tài)需要180 s(標尺：20 nm)[88]Fig.10 A time-lapse of each of the aggregates of PNCsundergoing coalescence. The process for the aggregated PNCs to coalesce and create a cohesive substance took 180 s, where separation between PNCs gradually reduced until there was no observable boundary between PNCs (Scale bars: 20 nm)[88]

圖11 FFA結晶前三種凝聚態(tài)團簇的形貌變化過程：高密度核形成，然后消耗亞穩(wěn)連續(xù)相中的物質，直到最終形成一個高密度的整體(標尺：20 nm)[88]Fig.11 Morphological changes of the three aggregates illustrating the pre-crystallization process of FFA: an electron dense nucleus develops and then consumes the material in the metastable cohesive entity until a final electron dense entity was formed (Scale bars: 20 nm)[88]

C?lfen等[89]用電位滴定法監(jiān)測了布洛芬成核的早期階段，布洛芬成核前經歷了液-液相分離過程，形成DLP，并以此作為成核的前驅體，如圖12所示。2D1H-1H NOESY NMR研究表明，DLP中和晶體中的分子間距離是類似的，在DLP內，與分子平移和旋轉相關的分子動力學過程減慢，布洛芬分子濃度更大，黏度高于周圍的液體環(huán)境，這也解釋了DLP在成核前一段時間內可以穩(wěn)定存在的原因。Vekilov等[64]也提出黏度對DLP中間體內有序核的形成起關鍵作用。

在過飽和的L-谷氨酸水溶液中，由于溶液與非晶態(tài)液滴之間的界面能較低，在能量上有利于形成非晶態(tài)中間體，如圖13所示，這種非晶態(tài)中間體是成核前團簇聚集形成的，隨后，非晶態(tài)中間體進一步合并，體系的總表面積減小，晶體的成核發(fā)生在非晶態(tài)中間體的內部，形成了兩步成核過程[90]。非晶態(tài)中間體的存在不僅僅決定了初始成核過程，也對晶體形態(tài)、尺寸分布、平均尺寸和相變過程產生影響。C?lfen課題組[77]采用電噴霧電離質譜(ESI-MS)、分析超速離心實驗(AUC)和原位原子力顯微鏡(in situ AFM)等表征手段，研究了DL-谷氨酸一水合物表面及溶液中存在的前驅體團簇，如圖14所示為團簇存在時晶體的多步結晶路徑：溶液中成核前團簇發(fā)生相分離，然后聚集形成更大的納米液滴，液滴吸附到晶體表面并擴展使界面能降低，三維納米前驅體逐漸轉變?yōu)槎S晶核，在溶液中納米液滴的補給下，二維晶核最終長成一個新的分子層。由此可見，這種無序的納米前驅體不僅僅與晶體的成核過程有關，在生長后期還起到了物質儲存的作用。

圖12 布洛芬的水解平衡及成核和晶體生長路徑[89]Fig.12 Protolysis equilibrium of ibuprofen with pathway of nucleation and crystal growth[89]

圖13 L-谷氨酸亞穩(wěn)區(qū)(MSZ)相分離初期非晶態(tài)中間體的TEM和SAED圖像，(a1～a4)、(b1～b4)和(c1～c4)分別對應不同的亞穩(wěn)區(qū)間[90]Fig.13 TEM images and SAED pattern of amorphous intermediates in initial stages of phase separation of L-glutamic acid in the metastable zones (MSZ): (a1～a4),(b1～b4) and (c1～c4) correspond to different MSZ respectively[90]

圖14 DL-谷氨酸一水合物晶體的多步生長路徑[77]Fig.14 Multistage growth pathway of DL-glutamic acid monohydrate crystal[77]

奧氮平(OZPN)是一種抗精神病藥物，屬于BCS Ⅱ類藥[91]，目前所得到的該藥物所有晶型(OZPN I, OZPN Ⅱ, OZPN Ⅲ)和三種二水合物(OZPN DB，OZPN DD，OZPN DE)中分子均以二聚體形式排列。Florence課題組[92]研究表明，在93%的相對濕度下，OZPN晶型I的表面可得到OZPN DD，而在攪動的水溶液中，晶型I表面首先產生OZPN DB，隨后轉變?yōu)楦€(wěn)定的OZPN DD。OZPN I表面OZPN DD的產生可總結為以下幾步：如圖15所示，A密集的納米液滴在OZPN I (100)面的臺階處形成，B液滴進一步聚集，C形成具有晶體特征的介觀尺度的液滴，D完全形成OZPN DD晶體排列在OZPN I (100)面上。OZPN晶型I在這里充當了模板的作用。當溶液處于攪動條件下，液滴從晶體表面脫附，失去模板效應，成核過程遵循路徑E～G，產生OZPN DB。這些密集的納米液滴不是一種穩(wěn)定相，它們沉積在晶體表面后通過與其他團簇凝結實現(xiàn)生長，即使在不飽和的OZPN水溶液或水-乙醇溶液中也存在，它們本質上是無序的，平均半徑為35 nm，在水溶液中，AFM下觀察到OZPN晶體(100)面上吸附著大小相近的團簇，如圖16(a)所示。非晶態(tài)團簇尺寸不隨OZPN濃度和溶劑組成而改變，根據(jù)模型假設OZPN分子形成二聚體并供給團簇生長，可以推斷：這種瞬態(tài)二聚體結構與OZPN已知晶體結構中的中心對稱二聚體相似，并且作為團簇基本組成單元存在[93]。

圖15 OZPN DD在晶型I表面和OZPN DB在溶液中的成核過程[92]Fig.15 Nucleation process of OZPN DD on the surface of OZPN I crystal and OZPN DB in solution[92]

圖16 AFM下OZPN凝聚態(tài)團簇(箭頭所示)在晶體表面的吸附 (a)在水中4 h后OZPN晶型Ⅰ(100)面的團簇，作為無水OZPN晶型I轉變?yōu)樗衔颫ZPN DD的動力學中間體;(b)EtOH/H2O 1/1(v/v)飽和溶液中1 h后OZPN/EtOH/H2O表面的團簇[93]Fig.16 Dense OZPN-rich clusters (indicated with arrows) on the surface of OZPN crystals imaged by AFM(a) clusters on (100) face of OZPN I after incubation in water for 4 h, these clusters are a kinetic intermediate in the transformation from anhydrous OZPN I to the hydrated form OZPN DD; (b) clusters on the surface of OZPN/EtOH/H2Oafter incubation for 1 h in saturated solution in EtOH/H2O 1/1 (v/v)[93]

晶體生長中生長單元到達臺階上的扭結點處具有兩種方式，生長單元直接結合到扭結點處或生長單元首先吸附到臺階面上，然后擴散到扭結點，如圖17所示，經典的晶體生長理論認為，晶體表面臺階的生長是通過溶質單體的結合實現(xiàn)的[94]，這種單分子反應使得臺階生長速率v與溶質濃度C之間呈線性關系，即：

v=βΩ(C-Ce)

(11)

式中：Ce為溶解度，說明分子吸附的可逆性；Ω為晶體內的分子體積；β為有效動力學系數(shù)，其中包含了與生長機理有關的動力學參數(shù)。

Vekilov課題組[95]對公式(11)作了進一步的推導，得出溶液中存在二聚體時臺階速率與溶質濃度的關系，如表2所示，所對應的曲線如圖18所示。奧氮平的2OZPN·EtOH·2H2O晶體臺階生長速率v與溶質濃度C之間的關系滿足上述第二種情況，生長速率v與溶質濃度C的二次方成正比，如圖19所示，拉曼測試與模擬進一步表明：晶體生長是以與溶質單體共存的二聚體為生長單元實現(xiàn)的。AFM下觀察到，具有較寬臺階面的臺階生長速率較快，證明了表面擴散機制的存在。

圖17 溶液中的生長單元結合到扭結點處的兩種方式(i)直接結合; (ii)首先吸附到臺階面上，然后向臺階擴散[95]Fig.17 Two pathways of a growth unit from solution to kinks: (i) direct incorporation and (ii) via adsorption on the terraces followed bydiffusion towards the steps[95]

圖18 不同情況下臺階速率與溶質濃度的關系(分別對應表2中的四種情況)[95]Fig.18 Correlations between step velocity and soluteconcentration under four cases (corresponding to four cases in table 2)[95]

表2 根據(jù)溶液中主要組分及生長單元類型劃分的四種情況下臺階速率v與溶質濃度C之間的動力學方程[95]Table 2 Kinetic laws that correlate step velocity v to the total solute concentration C for four cases classified according to the dominant solute species in solution and the form that incorporates into the steps[95]

圖19 2OZPN·EtOH·2H2O晶體生長臺階生長速率v與溶質濃度C之間的關系[95] Fig.19 Correlations between step velocity v and solute concentration C of 2OZPN·EtOH·2H2O crystal[95]

4 結語與展望

由于藥物分子的性質及生物利用度與其晶型息息相關，而最終產品的晶型由其成核和生長路徑決定，因此，對于藥物分子，其成核和生長路徑研究就變得非常重要，其結晶過程中是否經過中間態(tài)？或者是否經過瞬時的亞穩(wěn)晶型轉化而來？這些中間態(tài)與其最終晶型有怎樣的聯(lián)系？了解這些對于進行晶型主動調控，獲得具有自主知識產權的優(yōu)勢晶型有著重要的意義。從溶液化學的角度，根據(jù)晶核或PNC中的分子堆積方式與體塊晶體結構合成子是否存在對應關系，可以進一步解釋經典結晶與非經典結晶路徑。一方面，當晶核或PNC中的分子堆積方式與晶體結構合成子之間存在直接對應關系時，此時CNT是適用的；另一方面，當二者不存在一一對應關系時，溶液中已經形成的分子團簇可能充當了分子重排的位點，從而產生最終晶體結構中的超分子合成子，這種兩步自組裝過程對應了非經典的結晶路徑。

對于一個給定的藥物分子，可以通過分析分子結構和化學性質判斷可能存在的分子自組裝模式，結合計算模型進行穩(wěn)定性分析，得到分子的穩(wěn)定存在形式，即得到溶液化學的有效信息。即便如此，也很難預知分子在參與晶體生長時的復雜運動過程，如分子重排等。非經典結晶路徑涉及的中間態(tài)前驅體團簇通常也是難以預知的，需借助先進表征手段。因此，僅僅通過分子結構和化學性質難以預測藥物晶體的結晶路徑。盡管對非經典結晶過程的表征困難重重，而且目前還缺乏可靠的理論體系來輔助解釋該結晶過程，對該路徑的研究仍是極其必要的。從分子水平研究溶液、熔體中成核和生長過程，有賴于先進實驗手段的采用和理論的發(fā)展，藥物晶型控制是一個即具有基礎研究意義又具有巨大應用前景的領域，值得更多的晶體生長工作者關注！