超聲造影早期檢出聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞治療改善肝移植術(shù)后膽道缺血預(yù)后的初步探討

林躍君 鄭博文 吳濤 周慧超 廖梅 呂艷 何玉婷 任杰

非吻合口膽管狹窄（non-anastomotic biliary stricture，NAS）是肝移植術(shù)后最為棘手的膽道并發(fā)癥，發(fā)生率達(dá)5%～30%，是導(dǎo)致移植物失功及二次移植的主要原因[1-2]。目前NAS的治療方法包括內(nèi)鏡逆行胰膽管成像（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）、經(jīng)皮經(jīng)肝膽管引流術(shù)（percutaneous transhepatic cholangial drainage，PTCD）、膽腸吻合術(shù)等，但以上手段僅為對癥治療，二次移植往往是大多數(shù)受者最終的根治手段[3-6]。究其原因，可能是NAS的確診依賴于影像學(xué)提示膽管出現(xiàn)非吻合口處的多發(fā)狹窄、擴張等不可逆性形態(tài)學(xué)改變，而此時治療為時已晚。若能在膽管樹出現(xiàn)形態(tài)改變之前早期診治，則可能有望解決這一難題。

膽管周圍血管叢損傷導(dǎo)致的膽道缺血是肝移植術(shù)后發(fā)生NAS的主要危險因素之一，也是其重要的病理改變[7-8]。超聲造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）可動態(tài)描繪肝門部膽管微循環(huán)灌注情況，并可用于定性診斷膽道缺血及NAS[9-10]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有促進血管生成、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功能，已有其應(yīng)用于治療缺血性損傷的研究報道[11-14]。若在膽管出現(xiàn)嚴(yán)重形態(tài)學(xué)改變前，應(yīng)用CEUS早期檢出膽道缺血，并及時進行MSC治療，能否改善甚至逆轉(zhuǎn)NAS的不良預(yù)后？目前尚無相關(guān)研究。本研究回顧性分析肝移植術(shù)后4周內(nèi)應(yīng)用CEUS早期檢出膽道缺血并應(yīng)用MSC治療受者的長期預(yù)后，以初步探討MSC早期治療NAS的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2012年9月至2015年12月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院行肝移植且術(shù)后發(fā)生膽道缺血的9例受者的臨床資料。其中MSC治療組5例，男4例，女1例，年齡43（38，56）歲，原發(fā)病包括原發(fā)性肝癌（肝癌）2例、乙型病毒性肝炎肝硬化1例、慢性重型肝炎1例、肝惡性腫瘤（性質(zhì)不明）1例。常規(guī)治療組4例，均為男性，年齡53（48，61）歲，原發(fā)病包括乙型病毒性肝炎肝硬化2例、肝癌1例、丙型病毒性肝炎肝硬化1例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后4周內(nèi)CEUS提示膽道缺血（動脈期膽管壁無增強）[15]；（2）術(shù)后1年內(nèi)磁共振胰膽管成像（magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP）、ERCP或 PTCD確診 NAS。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）因原發(fā)性硬化性膽管炎接受肝移植；（2）因CEUS禁忌證無法行CEUS檢查；（3）肝移植術(shù)后1周內(nèi)死亡；（4）確診NAS前死亡；（5）確診NAS前診斷肝動脈血栓、移植物失功或肝癌復(fù)發(fā)。

1.2 治療方法

常規(guī)治療組僅行常規(guī)治療，治療方式包括護肝、利膽、介入治療等。MSC治療組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，分別于CEUS提示膽道缺血后1、2、4、8、12和16周接受MSC靜脈輸注，每次輸注1.0 × 106/kg人臍帶MSC（懸浮于100 mL生理鹽水）。臍帶的處理，MSC的提取、擴增和鑒定均在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院細(xì)胞基因治療及臨床轉(zhuǎn)化研究中心完成[16]。

1.3 檢查方法

CEUS檢查于肝移植術(shù)后4周內(nèi)進行。超聲儀采用Siemens Sequoia 512（美國），Toshiba Aplio 500（日本），選擇3.5～5.0 MHz凸陣探頭，選擇低機械指數(shù)的實時造影模式。使用聲諾維（SonoVue）造影劑（意大利Bracco公司），按說明書配置5 mL造影劑混懸液，經(jīng)肘靜脈團注1.5 mL。觀察肝門部及左右肝管匯合部，評估膽管血供情況。獲取持續(xù)6 min的CEUS錄像[9]。記錄CEUS動脈期、門靜脈期和延遲期膽管壁的增強情況（無增強、低增強、等增強、高增強），定義動脈期膽管壁無增強為膽道缺血[15]。

在出現(xiàn)黃疸、膽管炎、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平升高時采用MRCP、ERCP或PTCD確診NAS，NAS的診斷標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)移植肝內(nèi)外膽管非吻合口狹窄、擴張、形態(tài)異常，且無肝動脈栓塞。

1.4 研究內(nèi)容

所有受者隨訪時間截止至術(shù)后1年。分析兩組受者術(shù)后1年內(nèi)接受介入治療的情況，包括干預(yù)的首次時間和干預(yù)次數(shù)。分析兩組受者的預(yù)后，包括移植物失功及彌漫性膽管損傷的發(fā)生情況，其中彌漫性膽管損傷定義為多發(fā)肝內(nèi)膽管狹窄、膽管擴張、肝膿腫及膽瘺。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受者術(shù)后1年內(nèi)介入治療情況分析

MSC治療組僅2例受者需接受介入治療，首次治療時間為肝移植術(shù)后7～9個月，治療次數(shù)1～2次；常規(guī)治療組所有受者均需接受介入治療，首次治療時間早于MSC治療組，為術(shù)后1～3個月，治療次數(shù)2～6次。兩組典型病例的治療前后影像學(xué)檢查結(jié)果見圖1、2。治療前，CEUS均提示膽道缺血。肝移植術(shù)后1年，MRCP提示MSC治療組受者未見肝內(nèi)膽管狹窄，而PTCD提示常規(guī)治療組受者出現(xiàn)多發(fā)肝內(nèi)膽管狹窄。

圖1 1例肝移植術(shù)后CEUS提示膽道缺血接受常規(guī)治療受者的超聲表現(xiàn)Figure 1 Ultrasonic findings of 1 recipient received conventional treatment with biliary ischemia determined by CEUS after liver transplantation

圖2 1例肝移植術(shù)后CEUS提示膽道缺血且接受MSC治療受者的超聲表現(xiàn)Figure 2 Ultrasonic findings of 1 recipient received MSC treatment with biliary ischemia determined by CEUS after liver transplantation

2.2 兩組受者的預(yù)后情況分析

MSC治療組受者在MSC輸注期間未出現(xiàn)發(fā)熱、過敏、機會性感染等不良反應(yīng)。肝移植術(shù)后1年內(nèi)，MSC治療組2例受者發(fā)生彌漫性膽管損傷，未發(fā)生移植物失功；常規(guī)治療組所有受者均發(fā)生彌漫性膽管損傷，2例受者發(fā)生移植物失功。

3 討 論

各種原因?qū)е碌哪懙廊毖荖AS的病因之一，膽管形態(tài)學(xué)的改變往往繼發(fā)于膽道缺血[17]。目前NAS的確診依賴于影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)膽管形態(tài)學(xué)改變，而這一過程時間較長。蔡曉波等[18]和汪邵平等[19]報道NAS的確診時間為肝移植術(shù)后4.5個月和4.9個月。此時膽管形態(tài)學(xué)的改變往往已不可逆，受者可能早已錯失最佳治療時機。與檢測膽管形態(tài)學(xué)改變相比，通過CEUS檢測膽道缺血可更早預(yù)警NAS發(fā)生。有研究證實，CEUS不僅可用于檢測肝門部膽管微循環(huán)灌注，還可用于診斷膽道缺血及NAS[15]。在本研究中，9例受者均在肝移植術(shù)后4周內(nèi)通過CEUS檢出膽道缺血，且術(shù)后1年內(nèi)均確診為NAS，提示CEUS可早在術(shù)后4周內(nèi)即可對NAS的發(fā)生提出預(yù)警，臨床應(yīng)對此類受者進行早期干預(yù)。

目前對NAS的治療，主要為介入治療，但效果不佳[20-21]。Graziadei等[22]對19例肝移植術(shù)后NAS受者進行ERCP治療，平均隨訪39.8個月，無受者獲得完全緩解。Barbaro等[23]對33例肝移植術(shù)后NAS受者進行ERCP治療，僅12例受者獲得治療成功和臨床緩解。鑒于膽道缺血是NAS的病因之一，早期改善膽道缺血可能改善NAS的治療效果。

研究表明，移植肝膽管上皮丟失是膽管并發(fā)癥發(fā)生的病理基礎(chǔ)。膽管上皮可在供給足夠氧氣、營養(yǎng)的條件下快速充分再生，但若膽管周圍血管叢受損，不能給膽管上皮細(xì)胞提供足夠支持，則導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞再生不良，出現(xiàn)持續(xù)性膽管上皮壞死、脫落、纖維化，從而導(dǎo)致膽管狹窄[7]。Hansen等[24]對93例供者供肝在再灌注后及重建膽管吻合前進行活組織檢查，發(fā)現(xiàn)77例（83%）供肝伴顯著膽管上皮丟失。Brunner等[25]對79例供者供肝的肝外膽管在器官獲取和肝移植術(shù)中進行活組織檢查，發(fā)現(xiàn)86%供肝伴膽管上皮丟失。

MSC是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血細(xì)胞，不僅具有免疫調(diào)節(jié)功能，還有促進血管生成及組織再生作用[10-11,26-27]。本研究初次應(yīng)用MSC早期治療肝移植術(shù)后CEUS提示為膽道缺血的受者。此時膽管并未現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變，利用MSC的抗炎和免疫抑制功能，一方面可有效緩解局部微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，另一方面也可有效緩解膽管周圍血管叢的損傷并促進上皮細(xì)胞的修復(fù)再生，緩解膽管上皮的壞死、脫落、瘢痕化，減慢膽管狹窄這一嚴(yán)重不良預(yù)后的進展。在本研究中，接受MSC治療的受者均未發(fā)生移植物失功，需接受介入治療的時間晚于常規(guī)治療的受者，且次數(shù)較少，提示MSC治療對改善肝移植受者的預(yù)后、提高生活質(zhì)量有一定作用。但值得注意的是，MSC治療并未逆轉(zhuǎn)NAS的發(fā)生，著眼于多因素預(yù)防這一嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生可能更為重要，比如減少冷缺血和熱缺血時間、提高供肝質(zhì)量、提高手術(shù)技術(shù)等。

綜上所述，應(yīng)用CEUS早期檢出肝移植術(shù)后膽道缺血，并進行MSC治療可能有效改善肝移植術(shù)后NAS受者的預(yù)后，這為NAS的早期診治提供了潛在可能性。但MSC的最佳輸注劑量、療程、間隔時間等問題仍需進一步探討，今后還需進行更大樣本量的隨機深入研究。