肌腱蛋白-C在肝移植術(shù)后早期急性排斥反應(yīng)中的作用

曹薇薇 楊佩軍 李霄

隨著外科技術(shù)的發(fā)展，肝移植成為治療終末期肝病的唯一有效手段，但是肝移植術(shù)后缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）和急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）引起的早期移植物損傷仍是困擾臨床肝移植工作者的主要問題[1-3]。肝移植術(shù)后AR是由T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，以肝實(shí)質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、靜脈內(nèi)皮和膽管損傷為主要特征[4]。傳統(tǒng)免疫抑制劑的使用可在一定程度上降低AR的發(fā)生率，但其導(dǎo)致的一系列并發(fā)癥如原發(fā)性肝癌（肝癌）復(fù)發(fā)、術(shù)后感染、藥物性肝損傷等，嚴(yán)重影響受者的生存質(zhì)量[5-7]。此外，如處理不當(dāng)，AR可發(fā)展為慢性排斥反應(yīng)，嚴(yán)重影響移植肝的功能與受者的長期生存[8]。因此，尋找肝移植術(shù)后早期AR的標(biāo)志性分子和進(jìn)一步探討早期移植物損傷的潛在機(jī)制并開發(fā)新的治療靶點(diǎn)迫在眉睫[9-10]。

肌腱蛋白-C（tenascin-C，TNC）是細(xì)胞外基質(zhì)中重要的寡聚糖蛋白，在肝IRI和炎癥反應(yīng)中常作為促炎因子發(fā)揮作用[11-12]。TNC具有復(fù)雜的生物功能，在健康成人肝臟內(nèi)不表達(dá)，而在肝IRI、病毒性感染、炎癥反應(yīng)等病理生理過程中表達(dá)迅速上調(diào)，是肝損傷和炎癥反應(yīng)的重要分子標(biāo)志物[11,13-14]。本研究檢測了大鼠肝移植AR模型中TNC的表達(dá)情況，旨在探討TNC與肝移植術(shù)后AR的關(guān)系，為AR所致肝損傷的早期診斷和治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

近交系Brown Norway（BN）大鼠（6只）、Lewis大鼠（16只）均購于北京維通利華公司，飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽胰脾外科實(shí)驗(yàn)室無特定病原體（specific pathogen free, SPF）級動物房中，自由飲食。AR組選用Lewis大鼠（180～220 g）作為供體（6只），BN大鼠（200～240 g）作為受體（6只）；對照組選用Lewis大鼠（180～220 g）作為供體（5只），Lewis大鼠（200～240 g）作為受體（5只）。根據(jù)Kamada“二袖套法”在體視顯微鏡下行大鼠原位肝移植[15]。受體均于肝移植術(shù)后7 d取血清，處死后收集肝組織。每組3只受體用于病理學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色。每組所有受體均用于蛋白質(zhì)印跡法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）。

1.2 主要試劑

大鼠TNC ELISA試劑盒（NBP2-78768）購于美國Novus Biologicals公 司，TNC一 抗（EPR4219）購于英國Abcam公司，β-actin一抗購于美國Cell Signaling Technology公司，磷酸酶抑制劑CocktailⅠ購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病理學(xué)檢查 采用蘇木素-伊紅（hematoxylineosin，HE）對大鼠肝移植術(shù)后7 d移植肝組織進(jìn)行染色，采用Banff分級評估排斥活動指數(shù)（rejection activity index，RAI）評分，按照匯管區(qū)炎癥、膽管損傷和靜脈內(nèi)皮損傷的嚴(yán)重程度進(jìn)行評分（0～3分），評分之和為RAI[16]。

1.3.2 免疫組化染色 采用免疫組化染色檢測大鼠肝移植術(shù)后7 d移植肝TNC蛋白的表達(dá)情況。一抗4 ℃冰箱孵育過夜[磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作陰性對照]，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察并拍照，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色呈棕褐色為陽性。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠肝移植術(shù)后7 d移植肝TNC蛋白的相對表達(dá)量。TNC一抗（1:1 000）、β-actin一抗（1:2 000）孵育過夜，加相應(yīng)二抗（1:2 000）孵育2 h。采用Bio-Rad凝膠成像分析儀顯色，采用Image J軟件分析結(jié)果。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 收集肝移植大鼠術(shù)后7 d血清，采用ELISA檢測血清TNC的表達(dá)水平，并分析血清TNC表達(dá)水平與RAI評分的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析評價(jià)大鼠血清TNC表達(dá)水平與RAI評分的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝移植術(shù)后7 d移植肝組織病理學(xué)表現(xiàn)

大鼠肝移植術(shù)后7 d移植肝組織HE染色結(jié)果顯示，AR組匯管區(qū)可見大量以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，累及匯管旁肝實(shí)質(zhì)，靜脈內(nèi)皮周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，所有膽管上皮周圍均有炎癥細(xì)胞浸潤，少數(shù)膽管上皮出現(xiàn)局灶性管腔破壞，RAI評分5.0～9.0分；對照組匯管區(qū)少量炎癥細(xì)胞浸潤，膽管上皮和靜脈內(nèi)皮未累及，RAI評分1.0～3.0分（圖1）。

圖1 兩組大鼠移植肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，×200）Figure 1 Pathological findings of liver allograft tissues of rats in two groups

2.2 大鼠肝移植術(shù)后7 d移植肝組織TNC的表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，肝移植術(shù)后7 d AR組大鼠移植肝組織細(xì)胞外基質(zhì)中TNC陽性細(xì)胞分布多于對照組（圖2）。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，肝移植術(shù)后7 d AR組大鼠移植肝組織中TNC蛋白相對表達(dá)量高于對照組（t=5.112，P=0.007，圖3）。

圖2 兩組大鼠移植肝組織TNC陽性細(xì)胞分布情況（免疫組化，×200）Figure 2 Distribution of TNC positive cells of liver allograft tissues of rats in two groups

圖3 兩組大鼠移植肝組織TNC蛋白相對表達(dá)量Figure 3 Relative protein expression level of TNC of liver allograft tissues of rats in two groups

2.3 大鼠肝移植術(shù)后7 d血清TNC的表達(dá)水平

ELISA結(jié)果顯示，肝移植術(shù)后7 d AR組大鼠血清TNC表達(dá)水平高于對照組（t=3.152，P=0.012，圖4A）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清TNC表達(dá)水平與RAI評分呈正相關(guān)（r=0.790 9，P=0.004，圖4B）。

圖4 兩組大鼠肝移植術(shù)后血清TNC表達(dá)水平及與RAI評分的相關(guān)性Figure 4 Expression level of TNC in serum after liver transplantation and its correlation with RAI score of rats in two groups

3 討 論

肝移植術(shù)后早期移植物損傷主要包括AR和IRI[17-18]。有研究表明，肝移植術(shù)后AR的發(fā)生率為40%～70%[19]。雖然肝移植術(shù)后早期AR不會對受者的長期預(yù)后造成影響，但是若未及時處理，AR可發(fā)展為慢性排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植物失功甚至需二次肝移植[8]。AR診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是移植物穿刺活組織檢查，但因其有創(chuàng)、昂貴、耗時等缺點(diǎn)，未能普及[3,20]。而以肝功能指標(biāo)來評價(jià)移植物狀態(tài)存在一定的非特異性和滯后性，因此，探索新的分子靶點(diǎn)作為肝移植術(shù)后早期AR的診斷指標(biāo)具有重要意義[21-23]。

肝移植術(shù)后TNC的表達(dá)與肝免疫損傷的關(guān)系已有很多研究報(bào)道[24-25]。如丙型病毒性肝炎患者血清TNC表達(dá)水平異常升高，且其升高的程度與肝損傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[26]；當(dāng)給予高脂高膽固醇飲食時，與野生型小鼠比較，TNC敲除小鼠的肝腫大、肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤及肝纖維化程度均減輕[27]；敲除TNC后可顯著減輕小鼠肝損傷程度，抑制白細(xì)胞聚集，減少白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-17、CXC趨化因子配體（CXC chemokine ligand，CXCL）2等炎癥因子的分泌，并負(fù)性調(diào)控初始T細(xì)胞向輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）17轉(zhuǎn)化，減輕炎癥反應(yīng)程度[28]。此外，在刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠急性肝炎模型中，TNC敲除可抑制血清中促炎因子的表達(dá)和中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤[29-30]。上述研究提示TNC在肝臟炎癥反應(yīng)過程扮演著重要的角色。本研究團(tuán)隊(duì)前期將8例基因敲除小型豬作為供肝來源，對藏酋猴進(jìn)行輔助性脾窩異位肝移植，對移植肝術(shù)前和術(shù)后的轉(zhuǎn)錄基因差異表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后TNC顯著上調(diào)，進(jìn)一步提示TNC可能在移植物AR中發(fā)揮重要作用（研究待發(fā)表）。

本研究通過檢測大鼠肝移植AR模型中移植肝組織和血清TNC的表達(dá)水平，初步證明TNC與大鼠移植肝AR的關(guān)系。由于目前缺乏公認(rèn)的體外研究肝移植機(jī)制的細(xì)胞模型，因此TNC在AR中的具體作用機(jī)制仍未知，有待進(jìn)一步探索。此外，受限于肝移植術(shù)后肝組織標(biāo)本獲取困難，未使用臨床肝移植術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行TNC相關(guān)檢測，可在后續(xù)研究中予以補(bǔ)充。

綜上所述，TNC在肝移植術(shù)后AR中起重要作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。探索TNC在肝移植術(shù)后免疫損傷中的作用機(jī)制，可為臨床肝移植術(shù)后早期AR的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。