利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定軟棗獼猴桃倍性的方法

劉振盼

(遼寧省經(jīng)濟(jì)林研究所，遼寧 大連 116031)

軟棗獼猴桃Actinidiaarguta為獼猴桃科獼猴桃屬多年生木質(zhì)藤本植物[1]，其果實具有開胃健脾、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理功效[2]，被譽為“水果之王”[3]。該屬植物種類較多且倍性變異復(fù)雜，存在二倍體、四倍體、六倍體、八倍體以及非整倍體等倍性不同的系列，染色體小且倍性變異豐富[4]。在育種實踐中，不當(dāng)?shù)谋缎杂H本選配可能會造成雜交失敗、后代不育等后果。因此，進(jìn)行倍性鑒定不僅是開展獼猴桃常規(guī)育種親本選擇前提條件之一，也對其倍性育種等現(xiàn)代育種技術(shù)的開展具有重要意義。目前，多倍體鑒定常用的方法有兩種：一種是染色體計數(shù)法，另一種是流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)。與計數(shù)法相比，流式細(xì)胞技術(shù)雖然起步較晚，但因其高效快速、制樣簡單、試材用量少且數(shù)據(jù)重復(fù)性高等優(yōu)勢，成為目前最常用的植物基因組大小[5-8]或者植物倍性研究[9-10]的方法。本研究通過流式細(xì)胞儀對軟棗獼猴桃進(jìn)行倍性鑒定，以期建立一套高效的軟棗獼猴桃倍性鑒定技術(shù)，為后續(xù)的倍性育種和常規(guī)雜交育種等工作提供保障。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料均采自遼寧省經(jīng)濟(jì)林研究所松木島科研基地軟棗獼猴桃資源圃。2020年4月中旬在設(shè)施棚內(nèi)用剪刀剪取新抽出未展開的葉片，放入冰盒帶回實驗室，用預(yù)冷的清水洗去葉片表面的灰塵，然后用吸水紙擦干凈備用。供試植株樹齡4 a，每個品種采集5個葉片。倍性分析參照品種為‘紅陽’(2n=58)，測試樣品為‘魁綠’、‘桓優(yōu)1號’、‘安娜’、‘紫色薩瓦多’及自選雄株。

1.2 試驗方法

取新鮮待測樣本0.5 cm2，置于培養(yǎng)皿中。取Sysmex Partec CyStain UV Precise P 裂解液400 μL 加于樣本周圍，用鋒利刀片將其切碎，以充分提取出完整的細(xì)胞核，提取時間60 s。將培養(yǎng)皿中的液體用50 μm濾網(wǎng)過濾至樣品管中。向樣品管中加入Sysmex Partec CyStain UV Precise P 染液1 600 μL，染色60 s后上機測試。

待測樣品的倍性值估算方法：待測樣品的倍性值(ploidy value)=參照樣品的倍性×(待測樣品 G0/G1峰的熒光均值/參照樣品 G0/G1峰的熒光均值)。

2 結(jié)果與分析

本研究利用流式細(xì)胞儀對6個獼猴桃品種的染色體倍性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果見圖1。二倍體‘紅陽’G1其峰值在橫坐標(biāo)的位置是197.86 (圖1-A)，以此為對照進(jìn)行其他樣品的染色體倍性分析，根據(jù)DNA含量相對比例情況，從表1結(jié)果顯示：‘魁綠’其峰值橫坐標(biāo)位置是396.89，與對照品種的比值為2.01，判斷其為四倍體(圖1-B)；同理，‘桓優(yōu)1號’的峰值橫坐標(biāo)位置為392.16，與對照品種的比值為1.99，判斷其為四倍體(圖1-C)；‘安娜’的峰值橫坐標(biāo)位置為394.65，與對照品種的比值為1.99，判斷其為四倍體(圖1-D)；‘紫色薩瓦多’的峰值橫坐標(biāo)位置為395.57，與對照品種的比值為2.00，判斷其為四倍體(圖1-E)；自選雄株的峰值橫坐標(biāo)位置為585.62，與對照品種的比值為2.96，判斷其為六倍體(圖1-F)?？梢?，通過本試驗的方法，獲得主峰清晰、雜峰少，可以快速判斷材料的倍性。

表1 不同倍性獼猴桃屬植物細(xì)胞核DNA相對含量

圖1 流式細(xì)胞技術(shù)鑒定獼猴桃品種的相對DNA含量

注：A為‘紅陽’；B為‘魁綠’；C為‘桓優(yōu)1號’；D為‘安娜’；E為‘紫色薩瓦多’；F為自選雄株。單個熒光峰代表品種細(xì)胞核數(shù)量的相對熒光強度。

3 討 論

自1997年開始，國內(nèi)陸續(xù)開展了獼猴桃屬植物倍性鑒定工作[11-16]。前人研究表明，在獼猴桃屬內(nèi)，軟棗獼猴桃是倍性最為復(fù)雜的物種之一，存在2X、4X、6X、7X、8X等多種倍性水平，目前發(fā)現(xiàn)的物種以4X居多，6X較為少見[16]。由于軟棗獼猴桃倍性復(fù)雜，染色體量基數(shù)較大，給采用傳統(tǒng)的壓片法進(jìn)行其倍性鑒定帶來了困難。因此，建立準(zhǔn)確、高效的倍性鑒定技術(shù)十分必要。本方法通過采集軟棗獼猴桃的組培苗幼嫩葉片進(jìn)行倍性鑒定，建立了一套利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行軟棗獼猴桃倍性鑒定方法，該方法主峰清晰、雜峰少，適用于軟棗獼猴桃倍性的快速鑒定。

隨著軟棗獼猴桃產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，種質(zhì)創(chuàng)新越來越重要。雖然我國目前自主培育的軟棗獼猴桃品種較少，但我國擁有豐富的獼猴桃屬資源。這些資源不僅具有較強的商品特性(豐產(chǎn)、味美等)，而且具有較強的抗寒性，今后可通過雜交育種手段將其與國外優(yōu)良品種資源進(jìn)行雜交，也可通過多倍體誘導(dǎo)或融合等現(xiàn)代生物技術(shù)實現(xiàn)親本間的優(yōu)勢互補，開發(fā)出適宜不同生長環(huán)境的優(yōu)良軟棗獼猴桃新品種。采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定軟棗獼猴桃組培苗倍性，將為后續(xù)的倍性研究提供技術(shù)支撐。相對于傳統(tǒng)壓片法，流式細(xì)胞法具有樣品用量少、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點，是一種更為高效的鑒定染色體倍性的方法。