基于HPLC指紋圖譜及多成分含量測定的薄荷 與留蘭香藥材非揮發(fā)性成分比較研究

田偉，范帥帥，甄亞欽，高樂，王夢，牛麗穎

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2.河北省中藥配方顆粒技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050091； 3.河北省中藥材品質(zhì)評價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，河北 石家莊 050091

薄荷為唇形科植物薄荷Mentha haplocalyxBriq.的干燥地上部分，夏、秋二季莖葉茂盛或花開至三輪時(shí)采割[1]。薄荷屬植物既是藥食兩用、歷史悠久的清涼藥草，又是重要的芳香油原料，在中醫(yī)臨床及中藥制劑生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。全球薄荷屬植物約有30個(gè)種，140多個(gè)變種，我國共有12種。薄荷屬植物在世界各地廣泛栽培，栽培種主要有兩大類，一類是富含薄荷腦（menthol）的薄荷類[2]，另一類為富含香芹酮（carvone）的留蘭香類[3]。薄荷屬中藥的揮發(fā)性成分具有多種藥理作用，2015年版《中華人民共和國藥典》“薄荷”項(xiàng)下以揮發(fā)油為含量測定指標(biāo)。但薄荷的傳統(tǒng)入藥形式以水煎、后下為主，鮮薄荷、鮮留蘭香亦可直接食用，因此非揮發(fā)性成分的作用不容忽視。薄荷的非揮發(fā)性化學(xué)成分主要有黃酮類和有機(jī)酸類等，表現(xiàn)出良好的抗氧化能力[4-5]。對非揮發(fā)性成分進(jìn)行控制，可更全面評價(jià)薄荷屬中藥的質(zhì)量。

目前，指紋圖譜與多指標(biāo)含量測定的結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法已廣泛用于中藥材質(zhì)量控制和相近品種區(qū)分與鑒別等方面[6-10]，但關(guān)于薄荷與留蘭香非揮發(fā)性成分的系統(tǒng)比較尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用HPLC分析薄荷和留蘭香的非揮發(fā)性化學(xué)成分，建立其HPLC指紋圖譜。在此基礎(chǔ)上，建立薄荷和留蘭香藥材中隱綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷和香葉木素8種成分的含量測定方法，并對16批薄荷藥材和11批留蘭香藥材進(jìn)行含量測定，進(jìn)一步結(jié)合主成分分析和聚類分析，對薄荷和留蘭香進(jìn)行比較，以期為薄荷和留蘭香藥材的質(zhì)量控制提供方法和數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm），美國安捷倫公司；TB-215D電子天平（十萬分之一），BSA224S-CW電子天平（萬分之一），德國賽多利斯；KQ-250型超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司。

對照品隱綠原酸（批號(hào)PY20170224，純度99.8%），南京普怡生物科技有限公司；咖啡酸（批號(hào)110885-200102，純度100.0%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201818，純度96.2%），中國食品藥品檢定研究院；迷迭香酸（批號(hào)111820-201404，純度98.0%）、蒙花苷（批號(hào)111528-201509，純度98.0%），成都曼斯特生物技術(shù)有限公司；香葉木苷（批號(hào)PS020083，純度98.0%）、香葉木素（批號(hào)PS010395，純度98.0%）、香蜂草苷（批號(hào)PS14081801，純度98.0%），成都普思生物科技股份有限公司。甲醇、乙腈、乙酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。16批薄荷藥材（Y1～Y16）和11批留蘭香藥材（L1～L11）購自河北安國藥材市場和安徽亳州藥材市場，其中Y16、L9、L10、L11采收期為4月，產(chǎn)地見表1。經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠主任中藥師鑒定，分別為唇形科植物薄荷Mentha haplocalyxBriq.的干燥地上部分和唇形科植物留蘭香Mentha spicataL.的干燥地上部分，藥材標(biāo)本保存于河北省中藥材品質(zhì)評價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心。

表1 16批薄荷和11批留蘭香藥材來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm），以甲醇（A）-乙腈（B）-5%冰醋酸（C）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～15 min，8%→28%A，2%B；15～40 min，28%A，2%→15%B；40～65 min，28%A，15%→30%B；65～70 min，28%→8%A，30%→2%B），流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，指紋圖譜檢測波長為305 nm，含量測定時(shí)隱綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸、香葉木苷、蒙花苷、香葉木素檢測波長為330 nm，橙皮苷、香蜂草苷為284 nm。

2.2 混合對照品溶液制備

精密稱取隱綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸、香蜂草苷、香葉木素對照品適量，分別加甲醇溶解并稀釋，制備各自對照品貯備液；精密稱取橙皮苷、香葉木苷、蒙花苷對照品適量，分別加DMSO溶解并稀釋，制備各自對照品貯備液。分別精密吸取各對照品貯備液適量，置同一50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含隱綠原酸2.95 μg、咖啡酸1.92 μg、迷迭香酸33.28 μg、香葉木苷259.41 μg、蒙花苷125.03 μg、香葉木素0.84 μg、橙皮苷24.72 μg、香蜂草苷7.06 μg的混合對照品貯備液。

2.3 供試品溶液制備

取藥材粉末（過4號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含0.5%甲酸、30%DMSO的甲醇溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用含0.5%甲酸、30%DMSO的甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜建立與評價(jià)

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取薄荷藥材（Y1）粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以香葉木苷峰（7號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰的相對保留時(shí)間RSD≤0.5%，各共有峰的相對峰面積RSD≤2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取薄荷藥材（Y1）粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后0、3、6、12、20、36 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以香葉木苷峰（7號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰的相對保留時(shí)間RSD≤0.5%，各共有峰的相對峰面積RSD≤2.0%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取薄荷藥材（Y1）粉末，分別取低（0.1 g）、中（0.2 g）、高（0.3 g）水平樣品量，每個(gè)樣品量3份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以香葉木苷峰（7號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算低、中、高水平樣品量指紋圖譜中各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰的相對保留時(shí)間RSD≤0.5%，各共有峰的相對峰面積RSD≤3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 指紋圖譜相似度評價(jià)

取16批薄荷和11批留蘭香藥材粉末，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。將所得薄荷HPLC圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件，以樣品Y1圖譜作為參照圖譜，采用中位數(shù)法建立薄荷HPLC指紋圖譜，經(jīng)多點(diǎn)校正后，進(jìn)行色譜峰匹配，生成薄荷對照指紋圖譜。由于香葉木苷色譜峰（7號(hào)峰）分離情況較好、峰面積最大且保留時(shí)間居中，故以其為參照峰（S）。最終確定14個(gè)共有峰，通過與混合對照品溶液的色譜圖比對，指認(rèn)7個(gè)成分，分別為隱綠原酸（2號(hào)峰）、咖啡酸（4號(hào)峰）、橙皮苷（5號(hào)峰）、迷迭香酸（6號(hào)峰）、香葉木苷（7號(hào)峰）、香蜂草苷（9號(hào)峰）、蒙花苷（10號(hào)峰）。以薄荷對照圖譜為參照圖譜，導(dǎo)入11批留蘭香藥材的HPLC指紋圖譜，經(jīng)多點(diǎn)校正后，進(jìn)行色譜峰匹配，計(jì)算相似度。16批薄荷和11批留蘭香樣品指紋圖譜與薄荷對照圖譜的相似度見表2。所有批次薄荷與對照圖譜相似度均大于0.9，表明薄荷藥材的質(zhì)量較穩(wěn)定；8批夏、秋兩季采收的留蘭香與薄荷對照圖譜的相似度為0.890～0.996，表明留蘭香藥材與薄荷藥材整體相似，個(gè)別批次存在較小差異；4月采收的留蘭香與薄荷對照圖譜的相似度較差，表明采收期對藥材質(zhì)量影響較大。16批薄荷藥材和11批留蘭香藥材指紋圖譜見圖1、圖2。

表2 16批薄荷與11批留蘭香藥材指紋圖譜相似度分析結(jié)果

圖1 16批薄荷藥材HPLC指紋圖譜疊加圖及對照圖譜

圖2 11批留蘭香藥材HPLC指紋圖譜疊加圖及薄荷對照圖譜

2.5 含量測定

2.5.1 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品貯備液0.5、1、2、4、6 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到8種成分的系列濃度混合對照品溶液。分別精密吸取上述溶液及混合對照品貯備液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表3。隱綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷和香葉木素在各自的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表3 8種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算隱綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷和香葉木素的峰面積RSD分別為0.61%、0.62%、0.24%、0.21%、0.22%、0.20%、0.24%、0.28%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于制備后0、3、6、12、20、36 h進(jìn)樣10 μL，測得隱綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷和香葉木素的峰面積RSD分別為1.06%、1.27%、0.53%、0.52%、0.54%、0.79%、0.50%、1.12%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一份藥材粉末，分別取低（0.1 g）、中（0.2 g）、高（0.3 g）樣品量，每個(gè)樣品量3份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別測定隱綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷和香葉木素的峰面積，計(jì)算其含量RSD分別為1.85%、2.23%、1.09%、2.59%、2.02%、1.85%、1.14%、1.80%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn)

取同一批已知含量的樣品粉末，每3份為一組，每組精密加入對照品隱綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷和香葉木素的量相當(dāng)于樣品中各對照品含量的50%、100%、150%，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率及RSD。結(jié)果隱綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷和香葉木素的加樣回收率分別為101.0%、100.9%、100.7%、100.7%、99.9%、102.0%、99.1%、99.4%，RSD分別為1.95%、1.90%、1.90%、2.19%、1.84%、2.34%、1.98%、2.15%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.6 樣品含量測定

取16批薄荷和11批留蘭香藥材粉末，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，計(jì)算樣品中隱綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷和香葉木素的含量，結(jié)果見圖3、表4。

圖3 薄荷和留蘭香藥材中8種成分HPLC圖

表4 薄荷和留蘭香藥材中8種成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝2）

2.6 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.6.1 聚類分析

將16批薄荷和11批留蘭香藥材中8種成分的含量導(dǎo)入SPSS26.0軟件進(jìn)行分析，采用組間連接法，以歐氏距離平方為量度，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。4月采收的薄荷和留蘭香藥材與正常采收期樣品差異較大，根據(jù)采收期可分為兩類。

2.6.2 主成分分析

進(jìn)一步采用主成分分析對薄荷和留蘭香藥材進(jìn)行比較。前3個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率＞80%，三維散點(diǎn)圖見圖5。不同采收期的藥材在圖中分布離散，與聚類分析結(jié)果一致。

圖4 薄荷和留蘭香藥材聚類分析圖

圖5 薄荷與留蘭香藥材主成分分析

3 討論

薄荷含有多種化學(xué)成分，非揮發(fā)性成分主要為黃酮類和有機(jī)酸類等。迷迭香酸等有機(jī)酸類及香葉木苷、蒙花苷等黃酮類在波長330 nm處有較大吸收，橙皮苷、香蜂草苷等二氫黃酮在波長284 nm處有最大吸收，而在波長330 nm處紫外吸收很弱，因此含量測定時(shí)選擇波長284、330 nm同時(shí)監(jiān)測。采用二極管陣列檢測器對供試品溶液進(jìn)行200～400 nm全波長掃描，結(jié)果在波長305 nm處色譜峰數(shù)目較多且分離度良好，因此選擇305 nm作為指紋圖譜的檢測波長。

香葉木苷不溶于甲醇，橙皮苷和蒙花苷在甲醇中溶解度較低，故配制香葉木苷、橙皮苷和蒙花苷對照品貯備液時(shí)使用DMSO溶解稀釋。供試品溶液制備時(shí)考察含不同濃度DMSO和不同濃度甲酸的甲醇溶液對有效成分提取率的影響，加入DMSO可顯著提高橙皮苷、蒙花苷、香葉木苷和香蜂草苷的提取率，加入甲酸可提高隱綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸的提取率，但甲酸濃度過高會(huì)降低橙皮苷、蒙花苷、香葉木苷和香蜂草苷的提取率。結(jié)果顯示，含0.5%甲酸、30%DMSO的甲醇溶液提取效果最優(yōu)。

目前，薄荷的市場需求量越來越大，留蘭香是常見的薄荷偽品之一。關(guān)于薄荷和留蘭香揮發(fā)性成分的區(qū)別已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[11-13]：薄荷揮發(fā)油的主要成分為薄荷腦，不含香芹酮；留蘭香揮發(fā)油的主要成分為香芹酮，少含薄荷腦。此外，薄荷和留蘭香還含有大量非揮發(fā)性成分。本研究建立薄荷和留蘭香藥材的HPLC指紋圖譜，并比較了薄荷和留蘭香中8種指標(biāo)成分的含量。綜合指紋圖譜、多成分含量測定和化學(xué)計(jì)量學(xué)研究結(jié)果表明，薄荷和留蘭香所含非揮發(fā)性成分大體相似，薄荷中黃酮類成分的含量略高于留蘭香，而留蘭香中有機(jī)酸類成分的含量略高于薄荷，但差異并不顯著。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，薄荷黃酮類成分具有良好的抗病毒、抗氧化、抗炎等作用，與其臨床療效關(guān)系密切[4-5]。此前研究認(rèn)為薄荷中蒙花苷、橙皮苷含量較高，為主要的黃酮物質(zhì)[14-15]。考慮薄荷藥材的提取溶劑多為甲醇或甲醇水溶液，香葉木苷在甲醇和水中均不溶解，因此提取效率較低。本研究在提取溶劑中加入30%DMSO，與甲醇作為提取溶劑相比，對香葉木苷的提取效率提高近8倍，對橙皮苷和蒙花苷的提取效率提高3倍左右。薄荷藥材中香葉木苷的平均含量高達(dá)12 mg/g，高于蒙花苷和橙皮苷含量之和。香葉木苷能增加靜脈張力、改善靜脈通透性、改善微循環(huán)、抗炎、抗腫瘤等，目前已被開發(fā)為化學(xué)藥地奧司明[16]?！爸参锪籼m香作為制備治痔瘡病藥的應(yīng)用”已獲得國家專利[17]。香葉木苷作為薄荷和留蘭香中含量最高的黃酮類化合物，應(yīng)與蒙花苷、橙皮苷共同作為重要的含量控制指標(biāo)。

本研究采用HPLC建立薄荷、留蘭香藥材的HPLC指紋圖譜，同時(shí)測定了薄荷和留蘭香藥材中隱綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷和香葉木素8種化學(xué)成分的含量。所建立的方法簡便、準(zhǔn)確，可為薄荷和留蘭香藥材非揮發(fā)性成分的控制提供方法參考和數(shù)據(jù)支撐。

有研究報(bào)道，部位、采收期、產(chǎn)地的不同均對薄荷藥材中黃酮類成分含量有不同程度的影響[18]。本研究基于指紋圖譜和多指標(biāo)含量測定數(shù)據(jù)，綜合聚類分析和主成分分析結(jié)果，表明薄荷與留蘭香藥材中非揮發(fā)性成分無明顯差異，但采收期可能對薄荷和留蘭香的質(zhì)量產(chǎn)生較大的影響。不同采收期薄荷和留蘭香中迷迭香酸的含量差異最大，4月采收的樣品中迷迭香酸含量較夏秋采收者高近10倍。但本研究樣本量較小，今后將對不同采收期薄荷和留蘭香的非揮發(fā)性成分含量進(jìn)一步研究。