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    中藥有效部位提取技術(shù)與篩選方法應(yīng)用研究進(jìn)展

    2021-11-29 03:40:49張志軒崔樹(shù)婷朱中博彭超吳紅彥
    關(guān)鍵詞:藥效靶點(diǎn)溶劑

    張志軒,崔樹(shù)婷,朱中博,彭超,吳紅彥

    1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000; 2.深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院,廣東 深圳 518001

    中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn),分離純化中藥有效部位或有效成分,除去其他無(wú)效、低效或有毒成分,降低服用劑量,告別中藥制劑的粗糙過(guò)程已是大勢(shì)所趨[1]。中藥有效部位是其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ),也是其安全有效和質(zhì)量控制的關(guān)鍵,對(duì)揭示中藥多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)及中藥復(fù)方配伍內(nèi)在規(guī)律具有重要意義,中藥有效部位的提取與篩選對(duì)中藥新藥研發(fā)及指導(dǎo)臨床應(yīng)用有重要影響[2]。本文對(duì)中藥有效部位研究現(xiàn)狀,中藥提取、純化、分離技術(shù)及有效部位追蹤篩選方法做一綜述。

    1 提取技術(shù)

    中藥化學(xué)成分十分復(fù)雜,單味中藥往往含生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、萜類(lèi)、甾體、糖類(lèi)等多種化合物,復(fù)方中多味藥物配伍發(fā)揮功效不是簡(jiǎn)單的化學(xué)成分疊加,而且一味藥對(duì)不同疾病發(fā)揮功效的成分不同。因此,有效部位提取方法研究尤為重要,尋找有效且適宜的提取方法是辨識(shí)中藥活性部位的關(guān)鍵,也是明確中藥藥效活性成分的關(guān)鍵。

    1.1 溶劑提取法

    溶劑提取法是傳統(tǒng)的中藥提取方法。在中藥提取分離過(guò)程中,由于溶劑的滲透作用,溶劑不斷地進(jìn)入藥材組織細(xì)胞,直至細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,使中藥有效成分溶出。常用方法為水提取法、有機(jī)溶劑提取法、煎煮法、連續(xù)提取法。宋莉等[3]采用蒸餾水、70%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等不同極性溶劑對(duì)夏枯草活性成分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)夏枯草不同溶劑提取物均有抗氧化活性,其中有效部位主要集中在70%乙醇提取物,其總酚和黃酮含量最高,且夏枯草70%乙醇提取具有較高的DPPH·、·OH清除活性和脂質(zhì)體過(guò)氧化抑制活性,夏枯草蒸餾水提取物清除活性最佳。溶劑提取法受提取溶劑性質(zhì)及提取次數(shù)、溫度、壓力、時(shí)間等影響,且有提取周期長(zhǎng)、消耗溶劑大、純度低等缺點(diǎn)。

    1.2 超聲提取法

    超聲提取技術(shù)是近年來(lái)提取中藥有效成分的新工藝之一,是利用超聲波輻射藥物溶液產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)、空化效應(yīng)等,瞬時(shí)破壞藥材細(xì)胞壁,增強(qiáng)溶劑滲透作用,進(jìn)而增加中藥活性成分在溶劑中的溶出,具有提取率高、節(jié)省藥材與溶劑、提取時(shí)間短等優(yōu)勢(shì),適用于絕大多數(shù)有效成分的提取[4]。殷明陽(yáng)等[5]研究發(fā)現(xiàn),超聲提取法能提高提取率、縮短提取時(shí)間,適用于含多糖類(lèi)成分較多的中藥復(fù)方。超聲提取法雖具有提取率高的特點(diǎn),但與中藥有效成分狀態(tài)、極性、溶解性等密切相關(guān),也受超聲頻率、功率、時(shí)間等參數(shù)影響,適宜的超聲參數(shù)與在線測(cè)量技術(shù)問(wèn)題有待研究。

    1.3 超臨界萃取法

    超臨界萃取法是利用流體在超臨界狀態(tài)黏度接近氣體、密度接近液體、擴(kuò)散系數(shù)介于氣-液之間的特點(diǎn),以流體作為溶劑,通過(guò)改變溫度或壓力調(diào)節(jié)溶質(zhì)的密度,改變?nèi)苜|(zhì)的溶解能力,將有效部位提取出來(lái),對(duì)中藥不同成分的提取分離具有高選擇性。目前常用的流體多為CO2,具有較低的臨界度與臨界壓力、較高的溫度和壓力靈敏性,常用于中藥有效成分提取[6]。王小生等[7]通過(guò)CO2超臨界萃取法對(duì)艾葉進(jìn)行揮發(fā)油提取工藝篩選,發(fā)現(xiàn)艾葉有效部位提取條件為萃取壓力20 MPa、溫度30 ℃及分離壓力8 MPa、溫度55 ℃,該條件下艾葉揮發(fā)油平均提取率為1.443%、桉油精提取量為0.318 mg/g。雖然超臨界流體萃取具有很多優(yōu)勢(shì),但對(duì)中藥提取同樣存在局限性,超臨界萃取裝置價(jià)格昂貴,耗能較多,單獨(dú)使用常不能滿(mǎn)足有效成分純度的要求,且受中藥極性、分子量影響較大[8]。

    1.4 微波提取法

    微波提取是利用微波熱效應(yīng)對(duì)藥材及有機(jī)溶劑進(jìn)行加熱,根據(jù)不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同、吸收微波能力的差異,進(jìn)行中藥有效成分的溶出,達(dá)到提取目的。其提取效率高,操作簡(jiǎn)單便捷,廣泛用于中藥提取研究。微波提取經(jīng)清洗、粉碎、浸泡、微波、分離、濃縮、干燥、粉化后得到提取物[9],常用于提取黃酮類(lèi)、苷類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸、生物堿等中藥有效部位。劉丹彤等[10]在提取暖心方(紅參、熟附子、薏苡仁、橘紅)時(shí)采用單因素實(shí)驗(yàn)法發(fā)現(xiàn),微波提取有效成分最佳條件為功率1200 W、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)1次。對(duì)比其他提取法,微波提取工藝能縮短提取時(shí)間,節(jié)省物料成本,且有利于中藥復(fù)方的提取。但微波提取只適用于對(duì)熱穩(wěn)定的有效成分,對(duì)于熱敏性物質(zhì),微波加熱可導(dǎo)致其變性失活[11]。所以,在應(yīng)用微波提取時(shí)需要考慮溶劑類(lèi)型、提取時(shí)間、提取溫度、含水量、微波功率等因素影響。

    1.5 大孔樹(shù)脂吸附法

    大孔吸附樹(shù)脂通過(guò)表面系數(shù)、表面電性、形成氫鍵,選擇性吸附中藥內(nèi)有機(jī)化合物,具有選擇性好、穩(wěn)定性高、干擾因素少、可循環(huán)重復(fù)利用等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于分離中藥中有效部位和有效成分[12]。陳雪楓等[13]采用D101型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)九味羌活湯不同溶劑提取物進(jìn)行分離純化,以總化合物數(shù)量及固形物得率為純化指標(biāo),分別考察上樣量、濃度、洗脫濃度等因素對(duì)分離純化效率的影響,結(jié)果表明,大孔樹(shù)脂吸附法分離、純化九味羌活湯有效部位合理、穩(wěn)定、可行。劉飛等[14]通過(guò)抗病毒實(shí)驗(yàn),篩選佩蘭最佳提取方法發(fā)現(xiàn),AB-8弱極性大孔吸附樹(shù)脂對(duì)佩蘭的分離純化效果最佳,其體積分?jǐn)?shù)25%乙醇洗脫部位的T1值可達(dá)127.001,是佩蘭抑制腸道EV-71病毒的最佳有效部位。但大孔樹(shù)脂的吸附作用具有選擇性,對(duì)水溶性成分的分離效果明顯,對(duì)糖類(lèi)、色素的吸附作用較弱,在實(shí)際應(yīng)用中有局限性。

    1.6 超濾膜分離法

    超濾膜分離技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種高效、節(jié)能、無(wú)污染分離技術(shù),過(guò)程簡(jiǎn)單,不存在相的轉(zhuǎn)換,能最大限度保持成分穩(wěn)定,因此在現(xiàn)代中藥生產(chǎn)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[15]。劉力等[16]對(duì)白芍水提液有效部位進(jìn)行PVC超濾膜分離研究,通過(guò)不同孔徑的超濾膜過(guò)濾分離白芍水提液,取過(guò)濾前后的處理液用高效液相色譜法分析有效成分白芍總苷含量,結(jié)果顯示,大孔徑超濾膜超濾后濾液中白芍總苷含量明顯高于原液。

    2 有效部位篩選

    對(duì)于中藥活性的傳統(tǒng)鑒別手段,主要是形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和化學(xué)方法。但中藥有效部位既包含有效成分,又含有未闡明的活性成分[17],而運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)手段既能確定中藥有效部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),又能明確中藥其他部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[18]。

    2.1 基于體內(nèi)生理功能篩選中藥有效部位

    有效部位是中藥中具有相似化學(xué)性質(zhì)的一大類(lèi)化合物,而多個(gè)有效部位的集合就成為中藥藥效組分群。由于中藥的復(fù)雜性及現(xiàn)代研究手段的局限性,目前尚無(wú)法全面概括中藥的化學(xué)成分,而有效部位研究能在一定程度上明確中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。多指標(biāo)分析體內(nèi)代謝及生理功能也是追蹤篩選中藥有效部位的方法之一。龐漢青等[19]通過(guò)測(cè)定血瘀模型大鼠血液流變學(xué)、凝血功能等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)丹參不同有效部位均能改善血瘀大鼠血液流變學(xué)及凝血功能,以丹參總酚酸和丹參總酮聯(lián)合使用效果最優(yōu)。

    2.2 基于成分敲出技術(shù)篩選中藥有效部位

    中藥成分敲出(撤出)技術(shù),即研究中如果去除某一部分或某一味藥后對(duì)藥效影響很大,表明該成分或藥味是發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分;反之,表明該成分或藥味可用其他類(lèi)似藥物替代,或與其他組分不產(chǎn)生協(xié)同作用。黃偉強(qiáng)等[20]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證葛根抗腹瀉組分為葛根素、大豆苷、大豆苷元及3’-羥基葛根素,其有效組分抗腹瀉的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與葛根具有等效性,并且發(fā)現(xiàn)葛根、葛根有效組分及經(jīng)方均可有效抑制番瀉葉引起的小鼠腹瀉頻次,同時(shí)發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯組與去葛根芩連湯組療效無(wú)顯著差異,表明葛根活性成分與葛根在組方中具有相同作用。

    2.3 基于譜-效關(guān)系篩選中藥有效部位

    中藥譜-效研究過(guò)程是先通過(guò)合適的化學(xué)分析手段最大程度表征中藥的化學(xué)信息,將中藥指紋圖譜中化學(xué)信息與體內(nèi)外藥效結(jié)果結(jié)合起來(lái),采用合適的數(shù)據(jù)處理技術(shù)將“譜”與“效”聯(lián)系起來(lái),找出與藥效活性相關(guān)的有效部位或有效部位群,常用于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究[21]。周婷婷[22]通過(guò)建立磨盤(pán)草正丁醇部位指紋圖譜及抗炎效果觀察,發(fā)現(xiàn)磨盤(pán)草正丁醇部位對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹及棉球肉芽腫慢性炎癥均有明顯抑制作用,指紋圖譜比較分析顯示,正丁醇部位有效成分除來(lái)自原藥材的原型成分,還來(lái)源于小鼠代謝產(chǎn)物與應(yīng)激刺激。劉小花等[23]將黃芪指紋圖譜與小鼠利尿藥效相關(guān)聯(lián)進(jìn)行比較,篩選出黃芪乙酸乙酯部位為有效部位,乙酸乙酯部位利尿作用是其所有化學(xué)成分共同作用的結(jié)果,且該部位富含中等極性的黃酮類(lèi)化合物,能顯著提高小鼠排尿量,其指紋圖譜與利尿作用有一定對(duì)應(yīng)關(guān)系。目前,表征化學(xué)成分指紋圖譜技術(shù)存在一定局限性,亟待發(fā)展多種先進(jìn)技術(shù)或多技術(shù)聯(lián)用,以期盡量全面表征;藥效指標(biāo)選擇應(yīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合;而用于關(guān)聯(lián)譜-效的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)依據(jù)數(shù)據(jù)類(lèi)型合理選擇,必要時(shí)多種方法相互佐證,以保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

    2.4 基于體外模型細(xì)胞膜親和色譜篩選中藥有效部位

    生物色譜技術(shù)作為一種新型的技術(shù)用于中藥活性部位的篩選,主要包括分子生物色譜和細(xì)胞膜色譜,是通過(guò)藥物與大分子蛋白或細(xì)胞相互作用,達(dá)到分離、純化和篩選活性的目的。其中細(xì)胞膜色譜是近年來(lái)中藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),其依據(jù)提取物的成分與活性細(xì)胞是否具有特異親和能力而進(jìn)行藥效成分分離和鑒定,親和力高的成分即藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。侯曉芳等[24]利用細(xì)胞膜色譜法并結(jié)合離體藥理實(shí)驗(yàn),對(duì)四物湯中進(jìn)行拆方分析,發(fā)現(xiàn)川芎醇提后醋酸乙酯萃取部位是川芎發(fā)揮藥效有效部位,在此基礎(chǔ)上建立了以川芎有效部位為基礎(chǔ)的高效毛細(xì)管色譜指紋圖譜分析方法和高效液相色譜指紋圖譜分析方法。體外細(xì)胞膜色譜法能快速有效地對(duì)中藥有效部位和活性成分進(jìn)行初步篩選,為中藥高通量篩選提供途徑;與分子生物色譜相比,更具有整體性,更能體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性。然而,在篩選過(guò)程中,活性成分可能與功能性受體及非功能性受體相結(jié)合,篩選出的活性成分不能很好代表中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),需進(jìn)一步研究。

    2.5 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥有效部位

    近年來(lái),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為中藥研究熱點(diǎn),其系統(tǒng)性和整體性為中藥活性成分篩選研究提供新思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”的基礎(chǔ)上,采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龇椒A(yù)測(cè)藥物發(fā)揮藥效的活性成分[25],常用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)有 Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine(TCMIP)、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP)、Traditional Chinese Medicine Database等。其中,TCMSP是Ru等[26]在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)框架基礎(chǔ)上,建立的中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái),將中藥活性部位、藥物靶點(diǎn)、相關(guān)疾病可視化,自動(dòng)建立中藥活性物質(zhì)、藥物靶點(diǎn)和目標(biāo)疾病的網(wǎng)絡(luò)分析,為闡明中藥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、發(fā)現(xiàn)中藥關(guān)鍵活性物質(zhì)提供了基礎(chǔ),并得到廣泛運(yùn)用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)學(xué)科的語(yǔ)言,將復(fù)雜的生物系統(tǒng)相互作用抽象表達(dá)為網(wǎng)絡(luò),如何構(gòu)建符合中藥多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜關(guān)系仍是研究難點(diǎn)。

    2.6 基于功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選中藥有效部位

    活性蛋白組學(xué)技術(shù)是研究復(fù)雜蛋白質(zhì)組中酶活性的技術(shù),是使用基于活性的化學(xué)探針將特定酶的活性形式可視化,確定中藥活性成分在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。近年來(lái),越來(lái)越多中藥活性小分子探針被合成。Dai等[27]通過(guò)對(duì)黃酮類(lèi)化合物黃芩苷進(jìn)行定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)分析,合成基于黃芩苷活性的探針,確定肉堿棕櫚轉(zhuǎn)移酶1是黃芩苷的關(guān)鍵靶點(diǎn),而黃芩苷能顯著降低脂質(zhì)累積,有效改善因飲食誘導(dǎo)的肥胖及肝臟脂肪變性相關(guān)癥狀。

    2.7 基于腸道菌群技術(shù)篩選中藥有效部位

    近年來(lái),腸道菌群逐漸成為中藥活性成分的研究熱點(diǎn)。中藥通過(guò)口服進(jìn)入消化道,一部分直接通過(guò)胃黏膜吸收入血,另一些生物利用度較低的部分未經(jīng)上消化道吸收,通過(guò)小腸到達(dá)大腸,與腸道菌群接觸并發(fā)生相互作用,中藥有效部位成分不僅能改變腸道菌群代謝,且被腸道菌群轉(zhuǎn)化或代謝[28]。Yue等[29]通過(guò)對(duì)模型小鼠糞便樣品中細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)不易吸收入血的異喹啉類(lèi)生物堿小檗堿能參與腸道菌群支鏈氨基酸的合成與代謝,改善胰島素抵抗,并且能降低模型小鼠及糖尿病患者血清腸道菌群支鏈氨基酸水平。由于腸道內(nèi)活性成分是藥物被吸收代謝后進(jìn)入腸道,加之腸道內(nèi)容物復(fù)雜,因此,腸道菌群中活性物質(zhì)還需要藥效學(xué)驗(yàn)證,或聯(lián)合多組學(xué)分析推測(cè)代謝物的變化。

    3 小結(jié)及展望

    目前,中藥有效部位的復(fù)雜性限制其臨床應(yīng)用。主要體現(xiàn)在:①中藥是多種不同成分在不同時(shí)間段協(xié)同作用時(shí)發(fā)揮藥效,具有時(shí)-效性;②中藥炮制方法不同,其有效成分及功效不同,如生黃連、酒黃連、姜黃連和萸黃連,炮制方法不同,功效也有所不同;③中藥經(jīng)體內(nèi)代謝、腸道菌群代謝會(huì)產(chǎn)生新成分[30];④具有多方向功效類(lèi)集的中藥往往藥材本身所含活性成分含量較低,藥效呈量效性,但現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)無(wú)法全面檢測(cè)中藥有效部位,有些成分可能至今尚未發(fā)現(xiàn),使其作用被忽視,缺乏合理的動(dòng)物模型用于藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選[31]。中藥有效部位研究是中藥現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)的有效思路之一,近年來(lái),隨著現(xiàn)代科技與計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展,有效部位的提取分離、純化技術(shù)不斷完善,新技術(shù)、新設(shè)備層出不窮,但如何提高有效部位提取率及環(huán)保節(jié)能的提取制備法仍是今后研究的方向;其次,盡管中藥有效部位追蹤篩選技術(shù)在不斷提升,中藥有效部位在新檢測(cè)技術(shù)、多組學(xué)分析、多種生物學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)等方面也取得進(jìn)展,但認(rèn)識(shí)到中藥是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用于機(jī)體,單一檢測(cè)方法有一定局限性,運(yùn)用多學(xué)科聯(lián)合篩選方法更能體現(xiàn)中醫(yī)藥的全面觀、整體觀[31],也是中藥有效部位研究的趨勢(shì)。

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