黃芪甲苷對(duì)腦缺血小鼠外周免疫抑制作用的影響

鄒瑩香，李世春，王志菲

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，上海 201203

腦卒中又稱中風(fēng)、腦血管意外，是由腦血管破裂或血管阻塞導(dǎo)致腦供血不足而引起腦組織損傷的急性腦血管疾病，可分為缺血性和出血性卒中。在我國(guó)，缺血性卒中發(fā)病率遠(yuǎn)高于出血性卒中，是國(guó)民致死和致殘的主要原因之一[1]。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，85%腦卒中患者有并發(fā)癥，其中23%～65%并發(fā)感染[2]，且多為外周免疫抑制所致[3]。腦卒中患者免疫抑制主要表現(xiàn)在脾臟明顯萎縮，外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、活化受損[4]。因此，逆轉(zhuǎn)腦卒中后外周免疫抑制、減少并發(fā)感染可作為改善腦卒中患者預(yù)后的治療手段。課題組前期通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）大鼠模型證實(shí)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可抑制腦缺血后自然殺傷（NK）細(xì)胞向缺血腦區(qū)浸潤(rùn)、活化，改善腦缺血損傷；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可增加脾臟和外周血中NK細(xì)胞比例，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能具有改善腦缺血后外周免疫抑制的作用[5]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯以黃芪為君藥，其主要有效成分黃芪甲苷具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)以MCAO小鼠為模型，觀察黃芪甲苷對(duì)腦缺血后外周免疫抑制的影響，為腦卒中治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠56只，體質(zhì)量22～23 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2020-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（滬）2020-0009。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（PZSHUTCM18121409）。

1.2 藥物及制備

黃芪甲苷對(duì)照品，上海同田生物技術(shù)有限公司，CAS：84687-43-4，純度≥98%。稱取適量黃芪甲苷對(duì)照品，用聚乙二醇、丙二醇、無(wú)水乙醇、PBS配制成濃度為4 mg/mL的黃芪甲苷溶液。

1.3 主要試劑與儀器

異氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司，貨號(hào)R510-22-4；TTC，德國(guó)Sigma公司，貨號(hào)T8877；HBSS，生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號(hào)A003210；紅細(xì)胞裂解液，上海碧云天，貨號(hào)C3702；FITC標(biāo)記抗小鼠NK1.1，美國(guó)BD Biosciences，貨號(hào)553164；APC標(biāo)記抗小鼠CD3，美國(guó)BioLegend，貨號(hào)100236；PE標(biāo)記抗小鼠NKG2D，美國(guó)BioLegend，貨號(hào)115606；RPMI 1640培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco，貨號(hào)23400-021；BSA，德國(guó)BioFroxx，CAS：9048-46-8。動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)（美國(guó)哈佛儀器），多普勒血流儀（澳大利亞ADInstruments，Powerlab ML191），動(dòng)物手術(shù)體溫控制儀（美國(guó)哈佛儀器，K023986），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences），離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf，5810R）。

1.4 分組、造模和給藥

將51只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（13只）、模型組（20只）、給藥組（18只）。參照文獻(xiàn)[7]方法制備MCAO模型，使用呼吸麻醉機(jī)麻醉小鼠，體溫控制儀監(jiān)測(cè)小鼠肛溫，溫度控制在（37±0.5）℃，先后結(jié)扎小鼠頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，從頸總動(dòng)脈進(jìn)線栓至頸內(nèi)動(dòng)脈阻斷中動(dòng)脈血流，假手術(shù)組僅結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。多普勒血流儀監(jiān)控MCAO前后的血流值，將MCAO后血流值與MCAO前血流值比值保持在27%±0.5%。MCAO 45 min后，拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注，給藥組再灌注后按0.1 mL/10 g腹腔注射黃芪甲苷溶液，給藥劑量40 mg/kg，12 h后再次腹腔注射給藥1次，模型組和假手術(shù)組注射等量空白溶劑作為對(duì)照。

1.5 腦梗死體積測(cè)量

再灌注24 h后處死小鼠，將腦組織切成6個(gè)厚度1 mm腦片，放入2%TTC溶液，37 ℃水浴鍋避光染色，染色完成后拍照，使用Image J軟件測(cè)量每個(gè)腦片白色梗死區(qū)域面積，計(jì)算腦梗死體積（腦片梗死面積總和×腦片厚度）。

1.6 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

再灌注24 h后，采用改良的12點(diǎn)神經(jīng)評(píng)分系統(tǒng)[8]對(duì)小鼠神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評(píng)分，正常記0分，異常記1分，損傷越嚴(yán)重，總分越高。

1.7 脾臟和外周血自然殺傷細(xì)胞檢測(cè)

1.7.1 脾臟及外周血淋巴細(xì)胞分離

再灌注24 h后測(cè)量小鼠體質(zhì)量，眼球取血500 μL，處死后分離小鼠脾臟，稱重，放入培養(yǎng)皿中，加入2 mL RPMI 1640培養(yǎng)基研磨，勻漿轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液置于冰上裂解，輕輕搖晃，使其裂解充分，5 min后加等體積RPMI 1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)；4 ℃、350×g離心5 min，棄上清液，加入6 mL RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌，離心；沉淀用1 mL HBSS重懸，進(jìn)行計(jì)數(shù)細(xì)胞。外周血中加入4 mL紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解5 min（裂解步驟與脾臟相同）；4 ℃、300×g離心5 min，棄上清液，加入5 mL RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌；4 ℃、250×g離心5 min；沉淀用1 mL HBSS重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7.2 自然殺傷細(xì)胞標(biāo)記及檢測(cè)

取一定體積脾臟和外周血細(xì)胞懸液（含2×105個(gè)細(xì)胞），離心，100 μL 1%PBS稀釋抗體（每106個(gè)細(xì)胞加0.5 μL NK1.1、2.5 μL CD3、1.25 μL NKG2D），重懸細(xì)胞后，冰上靜置30 min，每管加入1 mL HBSS，4 ℃、4000 r/min離心6 min；棄去上清，沉淀加入300 μL HBSS重懸，使用流式管收集細(xì)胞，檢測(cè)NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例，并檢測(cè)NK細(xì)胞活力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±SE表示，多組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)模型小鼠腦梗死體積的影響

正常腦組織呈鮮紅色，腦缺血損傷后腦組織呈白色。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織明顯變白，腦梗死體積明顯增加（P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠腦組織變紅，腦梗死體積明顯減少（P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組小鼠腦組織形態(tài)（TTC染色）

表1 各組小鼠腦梗死體積比較（—x±SE，mm3）

2.2 黃芪甲苷對(duì)模型小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低（P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（—x±SE，分）

2.3 黃芪甲苷對(duì)模型小鼠體質(zhì)量和脾臟質(zhì)量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠體質(zhì)量和脾臟質(zhì)量減輕（P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠體質(zhì)量和脾臟質(zhì)量有所恢復(fù)（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠體質(zhì)量和脾臟質(zhì)量比較（—x±SE，g）

2.4 黃芪甲苷對(duì)模型小鼠脾臟和外周血自然殺傷細(xì)胞數(shù)量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠脾臟和外周血NK細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.05，P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠脾臟和外周血NK細(xì)胞比例明顯增加（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。

表4 各組小鼠脾臟和外周血NK細(xì)胞數(shù)量比較（—x±SE，%）

圖2 各組小鼠脾臟和外周血NK細(xì)胞流式示意圖

2.5 黃芪甲苷對(duì)模型小鼠脾臟和外周血自然殺傷細(xì)胞活力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠脾臟和外周血NKG2D表達(dá)明顯降低（P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠脾臟和外周血NKG2D表達(dá)明顯升高（P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)表5、圖3。

表5 各組小鼠脾臟和外周血NKG2D相對(duì)表達(dá)量比較（—x±SE，%）

圖3 各組小鼠脾臟和外周血NKG2D流式細(xì)胞術(shù)示意圖

3 討論

腦缺血屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，以突然昏仆、不省人事、言語(yǔ)不利、半身不遂為主癥。黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)固表、生津養(yǎng)血消腫等功效[9]。黃芪甲苷是黃芪的代表性成分，研究表明其具有抗炎、抗凋亡[10-11]、促進(jìn)神經(jīng)生發(fā)[12-13]及血管新生[14]等作用，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，防止中性粒細(xì)胞在腦缺血損傷大鼠腦內(nèi)聚集[15]。

腦缺血后免疫反應(yīng)分為2個(gè)階段：第1個(gè)階段是急性期，大量外周免疫細(xì)胞在不同時(shí)間浸潤(rùn)腦實(shí)質(zhì)，這些免疫細(xì)胞既破壞神經(jīng)結(jié)構(gòu)，也促進(jìn)組織修復(fù)[16]；第2個(gè)階段即腦缺血由急性期向亞急性期發(fā)展階段，也是本實(shí)驗(yàn)研究的外周免疫抑制階段，這個(gè)階段免疫系統(tǒng)由激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种茽顟B(tài)[4]，免疫抑制主要表現(xiàn)為淋巴器官萎縮、淋巴細(xì)胞減少及活化受損。研究顯示，MCAO 22 h后，小鼠脾臟和胸腺組織明顯縮小，脾臟紅髓中的造血成分顯著減少[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷24 h后，小鼠脾臟明顯萎縮，提示腦缺血導(dǎo)致外周免疫抑制的發(fā)生，黃芪甲苷給藥后脾臟質(zhì)量增加，表明黃芪甲苷可改善腦缺血后的免疫抑制。

另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，MCAO模型小鼠外周免疫器官及外周血中NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等淋巴細(xì)胞數(shù)量減少[18]。NK細(xì)胞同時(shí)具有固有免疫和適應(yīng)性免疫的特征[19]。一方面，在腦缺血損傷中，NK細(xì)胞是最早浸潤(rùn)入腦的免疫細(xì)胞之一，浸潤(rùn)的NK細(xì)胞可加劇神經(jīng)元死亡，增加局部炎癥及血腦屏障通透性，進(jìn)一步加重腦梗死[20-21]；另一方面，卒中誘發(fā)的免疫抑制容易使患者并發(fā)感染，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)，NK細(xì)胞通過(guò)清除感染細(xì)胞及產(chǎn)生干擾素-γ在宿主早期防御病原體中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血損傷后24 h，小鼠脾臟和外周血NK細(xì)胞比例下降，黃芪甲苷干預(yù)后，脾臟和外周血NK細(xì)胞比例升高，提示黃芪甲苷可改善腦缺血誘導(dǎo)的外周免疫抑制。NKG2D是NK細(xì)胞表面的激活性受體，在NK細(xì)胞活化中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，腦缺血損傷后24 h，小鼠脾臟及外周血NKG2D表達(dá)降低，黃芪甲苷可上調(diào)模型小鼠脾臟及外周血NKG2D的表達(dá)，提示黃芪甲苷可增加腦缺血后外周血中NK細(xì)胞活力。

綜上，黃芪甲苷可增加腦缺血后脾臟和外周血NK細(xì)胞的數(shù)量和活力，改善脾臟萎縮，提示黃芪甲苷可能通過(guò)改善外周免疫抑制發(fā)揮保護(hù)腦缺血損傷的作用。本研究有助于了解中藥單體成分在腦缺血損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用及其可能的作用靶點(diǎn)，為腦卒中的臨床治療提供依據(jù)。