基于RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析一貫煎對 酒精性脂肪性肝病小鼠TGFBR2受體表達(dá)的影響

邱豐俊，李杜，朱一唯，閆曉風(fēng)，葉?杰，王曉玲，胡旭東

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

酒精性脂肪性肝?。╝lcoholic fatty liver disease，AFLD）是長期過量飲酒而導(dǎo)致肝臟的早期病變，主要以肝臟中脂質(zhì)沉積為特征[1]。酒精已成為慢性肝病的主要因素之一[2]。Ohashi等[3]發(fā)現(xiàn)，約90%酗酒者會發(fā)展為AFLD，并進(jìn)一步發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化，甚至肝硬化等。因此，防治AFLD對遏制肝臟不可逆損傷從而截斷酒精性肝病進(jìn)程有重要意義。一貫煎是養(yǎng)肝陰、疏肝氣中醫(yī)經(jīng)典方劑，對酒精性肝病患者有良好的降脂和保肝作用[4]，但一貫煎治療AFLD的具體分子機制尚未闡明。因此，本研究通過AFLD小鼠模型和細(xì)胞模型，探討一貫煎防治AFLD的潛在信號通路。

1 實驗材料

1.1 動物和飼料

C57BL/6雌性小鼠24只，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0006，動物使用許可證號SYXK（滬）2014-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)室，動物倫理審查編號PZSHUTCM190712014。Lieber-DeCarli液體飼料（TP4030C、TP4030D），購于江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 細(xì)胞和藥物

AML12小鼠肝細(xì)胞株（ATCC編號CRL-2254），購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。一貫煎（生地黃18 g，北沙參10 g，麥冬10 g，當(dāng)歸10 g，枸杞子12 g，川楝子4.5 g），飲片購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，按原方比例和制法由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑中心制成流浸膏，再由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制成干粉（批號20180515），冷藏保存，每克干粉含原藥材2.196 g。

1.3 主要試劑與儀器

無水乙醇（滬式10009218AR）、二甲基亞砜（滬式30072418AR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰酶（貨號25200-072）、DMEM/F12培養(yǎng)基（貨號12400-024）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（貨號41400-045），Thermo Fisher Scientific公司；地塞米松（貨號D1756），Sigma公司；青-鏈霉素溶液（貨號GNM15140），吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；Nile Red熒光染料（貨號HY-D0718）、DAPI熒光染料（貨號HY-D0814），MCE公司；總RNA提取試劑盒（貨號15596026），Life Technologies公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號K1622），Thermo Fisher Scientific公司；擴(kuò)增試劑盒（貨號M3003L），Luna公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（貨號C009-1）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（貨號C010-1）、三酰甘油（TG）測試盒（貨號A110-1），南京建成生物工程研究所；TGFBR2抗體（貨號abs101230）、SLC2A4抗體（貨號abs131486），愛必信（上海）生物科技有限公司。Forma371細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司），BSC-1600IIB2生物安全柜（上海上凈凈化設(shè)備有限公司），5418R低溫離心機（Eppendorf公司），Axiovert40 CFT熒光倒置生物顯微鏡（徳國Zeiss公司），Synergy 2酶標(biāo)儀（BioTek公司），LightCycler96實時熒光定量PCR儀（Roche公司）。

2 實驗方法

2.1 造模及給藥

將小鼠隨機分為對照組、模型組和一貫煎組，每組8只。按照文獻(xiàn)[5]方法制備AFLD小鼠模型。對照組給予Lieber-DeCarli液體飼料（TP4030C）喂養(yǎng)15 d；模型組和一貫煎組先予Lieber-DeCarl液體飼料（TP4030C）適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，再連續(xù)喂食含5.0%乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料（TP4030D）10 d。同時一貫煎組每日給予一貫煎溶液灌胃，對照組和模型組按體質(zhì)量給予等體積生理鹽水灌胃。第16日上午，對照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，一貫煎組予一貫煎溶液灌胃；1 h后模型組和一貫煎組按20 μL/g小鼠體質(zhì)量給予31.5%乙醇（V/V）灌胃，對照組按相同劑量予45.0%糊精（W/V）灌胃；9 h后（期間禁食不禁水）處死所有小鼠，取肝組織備用，血液標(biāo)本以3000 r/min離心15 min，取上層血清分裝備用。

一貫煎溶液配制：每次稱取一定量一貫煎干粉，生理鹽水溶解，配制成濃度為含原藥材0.793 8 g /mL一貫煎溶液，預(yù)熱后每日給予7.938 g/kg（按65 kg成人體質(zhì)量臨床用量8倍）劑量進(jìn)行小鼠灌胃[6]。

2.2 HE染色

石蠟切片，脫蠟至水（將切片依次放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精5 min，自來水洗）；蘇木素染色（將切片放入蘇木素染液染3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水再洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗）；伊紅染色（將切片依次放入85%、95%酒精分別脫水5 min，然后放入伊紅染液中染色5 min）；脫水封片（將切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min透明，中性樹膠封片）；顯微鏡觀察，圖像采集分析。

2.3 油紅O染色

油紅O染色法常用于組織內(nèi)TG等中性脂肪的特異性染色。按貯備液∶稀釋液＝5∶2配制油紅O應(yīng)用液，配好后濾紙過濾2遍，去除殘渣。將肝組織冰凍切片放置在切片架上，室溫回溫10 min，然后將切片放入裝有油紅O應(yīng)用液的染缸中染色13 min，37 ℃蒸餾水洗20 s，復(fù)染液中染色5 min，自來水洗60 s，表面水分干透前滴加水性封固劑加蓋玻片封片，鏡下觀察肝組織內(nèi)脂肪生成情況。

2.4 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和三酰甘油含量測定

將5 μL血清樣本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品分別加入96孔板，各孔分別加入20 μL基質(zhì)液，37 ℃水浴孵育30 min；各孔分別加入20 μL 2,4-二硝基苯肼液，37 ℃水浴孵育20 min；各孔分別加200 μL 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，室溫放置15 min，于酶標(biāo)儀波長510 nm處測定各孔OD值，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算血清ALT、AST含量。將2.5 μL血清樣本加入96孔板，同時設(shè)校準(zhǔn)孔和空白孔；加入200 μL工作液，37 ℃水浴孵育10 min，于酶標(biāo)儀波長510 nm處測定各孔OD值，計算TG含量。TG（mmol/L）＝（樣本OD值－ 空白OD值）÷（校準(zhǔn)OD值－空白OD值）×校準(zhǔn)品濃度（2.26 mmol/L）。

2.5 RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.5.1 測序

根據(jù)試劑盒（RNAiso Plus試劑盒和RNeasy Mini試劑盒）的標(biāo)準(zhǔn)操作流程分別抽取各組小鼠肝組織樣本總RNA，所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100電泳質(zhì)檢合格后，使用RNAClean XP Kit和RNase-Free DNase Set對總RNA進(jìn)行純化。將純化后的總RNA進(jìn)行mRNA的分離、片段化、第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成、末端修復(fù)、3’末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構(gòu)建。所建文庫分別采用Qubit?2.0 Fluorometer檢測其濃度，Agilent2100檢測文庫大小。依據(jù)cBot操作指南中的相應(yīng)流程，采用Illumina測序儀配套的cBot完成cluster的生成和第一向測序引物的雜交。依據(jù)Illumina User Guide提供的測序試劑，將帶有cluster的流動池上機，用paired-end程序進(jìn)行雙端測序。并采用Illumina提供的數(shù)據(jù)收集軟件對測序進(jìn)行控制，同時進(jìn)行實時數(shù)據(jù)分析。

2.5.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

通過Seqtk（https∶//github.com/lh3/seqtk）對測序所得讀長進(jìn)行篩選，主要過程：去除讀長中的接頭序列；去除3’端質(zhì)量Q＜20的堿基（堿基錯誤率＜0.01）；去除長度＜25的讀長；去除所屬物種的核糖體RNA數(shù)據(jù)。用篩選后的測序讀長進(jìn)行下一步分析。

2.5.3 基因表達(dá)差異性分析和KEGG富集

為獲得樣品的可比較差異基因數(shù)據(jù)，通過StringTie軟件計數(shù)、TMM（M值的修剪平均值）標(biāo)準(zhǔn)化和perl腳本計算3個步驟將測序讀長轉(zhuǎn)換為FPKM（每百萬映射讀長外顯子模型的每千個堿基片段），從而將基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。采用edgeR[7]進(jìn)行樣本間差異基因分析，得出P值后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗校正，通過控制FDR（false discovery rate）決定P的閾值，校正后的P值即q值。同時，根據(jù)FPKM值計算差異表達(dá)倍數(shù)。差異基因篩選條件如下：q≤0.05，差異表達(dá)倍數(shù)≥2。以上實驗委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。

篩選出模型組和正常組的差異表達(dá)基因及一貫煎組和模型組的差異表達(dá)基因后，將篩選出的差異基因作進(jìn)一步交集分析，并將交集中的差異表達(dá)基因?qū)隓AVID Bioinformatics Resources 6.8（https∶//david. ncifcrf.gov/summary.jsp）完成KEGG通路富集分析。

2.6 RT-qPCR檢測

將RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序后返回的肝組織樣本總RNA進(jìn)行部分基因的RT-qPCR實驗，檢驗RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。首先將樣本總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)一步擴(kuò)增，用2-ΔΔCt法定量分析，以GAPDH為內(nèi)參，檢測各組樣本中FOXO信號通路（KEGG富集所得分析差異最顯著的信號通路）相關(guān)基因表達(dá)變化。所有引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

稱取0.301 g一貫煎干粉（每克干粉含原藥材2.196 g），溶于3 mL完全培養(yǎng)液，制成原藥材濃度為220 mg /mL的一貫煎母液，0.22 μm濾膜過濾，每管50 μL分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將AML12細(xì)胞按104cells/孔接種于96孔板，使用含10%FBS、1%ITS、40 ng/mL地塞米松的DMEM/F12培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)實驗設(shè)計對照組、模型組（50 mmol/L酒精）、一貫煎組（50 mmol/L酒精＋一貫煎900、300、100、33 μg/mL）、TGFBR2抗體組（50 mmol/L酒精＋TGFBR2抗體500、50、5 ng/mL）、SLC2A4抗體組（50 mmol/L酒精＋SLC2A4抗體500、50、5 ng/mL），加入相應(yīng)試劑后分別孵育24 h，待測。

2.8 Nile Red染色

Nile Red是一種廣泛使用的親脂性熒光染料，可用于評價細(xì)胞中TG等中性脂肪的含量[8]。將孵育24 h的96孔板從培養(yǎng)箱中取出，吸去細(xì)胞上清液，PBS洗3次；10%中性福爾馬林常溫固定細(xì)胞20 min，PBS洗3次；用1 μg/mL Nile Red染液37 ℃染色10 min，PBS洗3次；37 ℃、1 μg/mL DAPI染細(xì)胞核10 min，PBS洗3次，熒光顯微鏡下拍照，用Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，不同樣本之間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 HE染色結(jié)果

模型組酒精液體飼料喂養(yǎng)后，小鼠肝細(xì)胞呈脂肪樣空泡，氣球樣變明顯，肝索結(jié)構(gòu)紊亂；一貫煎組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)空泡狀物質(zhì)減少，氣球樣變減少。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.2 油紅O染色結(jié)果

模型組小鼠肝組織中紅色脂滴含量增加，且脂滴明顯變大；一貫煎組脂滴變小，含量降低。見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織TG含量比較（油紅O染色，×200，±s，n＝3）

4.3 一貫煎對模型小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和三酰甘油含量的影響

與對照組比較，模型組小鼠血清ALT、TG含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）；與模型組比較，一貫煎組小鼠血清ALT、TG含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）；模型組、一貫煎組血清AST含量較對照組均增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠血清ALT、AST、TG含量比較（±s，n＝3）

4.4 靶點基因及主要靶點通路篩選結(jié)果

與對照組比較，模型組817個基因顯著上調(diào)，358個基因顯著下調(diào)；與模型組比較，一貫煎組197個基因顯著上調(diào)，347個基因顯著下調(diào)。為明確一貫煎防治AFLD小鼠主要靶點基因，對模型組與對照組及一貫煎組與模型組的差異表達(dá)基因進(jìn)行交集分析。共得到133個靶點基因，其中模型組表達(dá)降低、一貫煎干預(yù)后表達(dá)升高的靶點基因33個；模型組表達(dá)升高、一貫煎干預(yù)后表達(dá)降低的靶點基因100個。將交集分析所得的133個靶點基因進(jìn)一步通過KEEG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號通路富集。結(jié)果顯示，靶點基因在FOXO通路上富集最為顯著（P＝8.8E-3），共有5個靶點基因分布在該通路，分別是TGFBR2、SLC2A4、KLF2、SGK2、TNFSF10（見表2、圖4），其中TGFBR2和SLC2A4是細(xì)胞膜受體蛋白。該結(jié)果提示，一貫煎可能通過TGFBR2和SLC2A4介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮防治小鼠AFLD的作用。

4.5 RT-qPCR驗證結(jié)果

差異基因RT-qPCR檢測結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果一致，見圖5、表3。

表2 一貫煎防治小鼠AFLD靶點基因KEGG通路富集結(jié)果

圖4 一貫煎治療AFLD關(guān)鍵靶點及其相關(guān)信號通路示意圖

圖5 各組小鼠肝組織TGFBR2、SLC2A4、KLF2、SGK2、TNFSF10基因表達(dá)比較（±s，n＝3）

表3 FOXO通路差異基因表達(dá)變化倍數(shù)

4.6 TGFBR2和SLC2A4抗體對AML12細(xì)胞脂肪變性的影響

小鼠肝組織RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，細(xì)胞膜受體蛋白TGFBR2和SLC2A4可能在小鼠肝細(xì)胞脂肪變性過程中發(fā)揮重要作用，因此后續(xù)通過酒精體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性進(jìn)行進(jìn)一步驗證。分別使用濃度為500、50、5 ng/mL的TGFBR2和SLC2A4抗體與50 mmol/L酒精同時孵育AML12細(xì)胞。結(jié)果顯示，各濃度SLC2A4抗體對酒精誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)生成作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TGFBR2抗體50、5 ng/mL能顯著抑制酒精誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)生成（P＜0.05），且50 ng/mL TGFBR2抗體降脂效果更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖6。提示TGFBR2與肝細(xì)胞酒精性脂肪變性密切相關(guān)，后續(xù)研究選用50 ng/mL的TGFBR2抗體進(jìn)行實驗。

圖6 不同濃度TGFBR2和SLC2A4抗體對AML12細(xì)胞脂肪變性的影響（Nile Red染色，±s，n＝3）

4.7 一貫煎對酒精誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞脂肪變性的影響

為驗證一貫煎對酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性的影響，將原藥材濃度分別為900、300、100、33 μg/mL一貫煎溶液與50 mmol/L酒精同時孵育AML12細(xì)胞24 h，結(jié)果300 μg/mL一貫煎溶液抑制脂質(zhì)生成效果最明顯（P＜0.001），見圖7。因此，后續(xù)研究選用濃度為300 μg/mL一貫煎溶液進(jìn)行實驗。

4.8 一貫煎和TGFBR2抗體對AML12細(xì)胞脂肪變性的影響

將300 μg/mL一貫煎溶液和50 ng/mL TGFBR2抗體單獨或聯(lián)合與50 mmol/L酒精共同孵育AML12細(xì)胞。結(jié)果300 μg/mL一貫煎、50 ng/mL TGFBR2抗體、300 μg/mL一貫煎＋50 ng/mL TGFBR2抗體均能顯著減輕酒精誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)生成，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1），見圖8。提示一貫煎可能通過TGFBR2通路減輕酒精誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞脂肪變性。

圖7 不同濃度一貫煎對酒精誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞脂肪變性的影響（Nile Red染色，±s，n＝3）

圖8 一貫煎和TGFBR2抗體對AML12細(xì)胞脂肪變性的影響（Nile Red染色，±s，n＝3）

5 討論

一貫煎出自《續(xù)名醫(yī)類案》，由北沙參、麥冬、當(dāng)歸、生地黃、枸杞子、川楝子6味中藥組成[9]，主治肝腎陰虛證，可統(tǒng)治脅痛、吞酸、吐酸、疝瘕一切肝病[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，其對酒精性肝病具有一定作用[4]。研究表明，一貫煎可降低酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、堿性磷酸酶和總膽紅素等水平，對酒精灌胃所致大鼠肝細(xì)胞損傷有一定防治作用[11]。此外，一貫煎具有抗脂肪肝功能[12]，但防治AFLD的分子機制尚無報道。本研究通過一貫煎灌胃給藥作用于AFLD模型小鼠，結(jié)果顯示其可顯著降低小鼠血清ALT、TG含量，減輕小鼠肝損傷及肝臟脂肪變性。體外細(xì)胞實驗也表明，一貫煎可顯著減輕酒精誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞脂肪變性。

RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)又稱全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序，主要以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)，將mRNA、small RNA和non-coding RNA等通過高通量測序技術(shù)檢測其堿基序列[13]。針對中藥具有多組分、多靶點的特點，為進(jìn)一步明確一貫煎改善小鼠AFLD的分子機制，本實驗采用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測小鼠肝組織基因表達(dá)，共發(fā)現(xiàn)了133個差異表達(dá)基因。通過差異表達(dá)基因的KEEG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO信號通路基因關(guān)聯(lián)度最高（P＝8.8E-3），TGFBR2、SLC2A4、TNFSF10、KLF2、SGK2這5個基因富集于FOXO信號通路，其中TGFBR2和SLC2A4是膜受體蛋白。進(jìn)一步的體外細(xì)胞實驗顯示，拮抗TGFBR2受體蛋白可顯著減輕酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性，但拮抗SLC2A4受體蛋白并不能減輕酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性，表明TGFBR2介導(dǎo)的信號通路在小鼠AFLD進(jìn)程中起到更重要的作用。細(xì)胞實驗結(jié)果還顯示，一貫煎、TGFBR2抗體單用或聯(lián)用均能顯著減輕酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)生成，但三者作用相互間無明顯差異，提示一貫煎可能通過TGFBR2通路減輕酒精誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞脂肪變性。

金云云[14]發(fā)現(xiàn)，TGFBR2與成脂細(xì)胞分化和凋亡相關(guān)；Yang等[15]使用肝細(xì)胞特異性TGFBR2基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，TGFBR2缺失后可通過增加與β氧化相關(guān)基因的表達(dá)減輕膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥?？梢奣GFBR2與調(diào)控細(xì)胞脂質(zhì)代謝有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TGFBR2通路與AFLD聯(lián)系密切，但具體分子機制尚需進(jìn)一步探索和闡明。

綜上所述，一貫煎可能通過影響小鼠肝細(xì)胞膜受體蛋白TGFBR2介導(dǎo)的信號通路，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，從而減輕酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性，起到防治AFLD的藥理效應(yīng)。