利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測算紅螯螯蝦實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)量

鄭在超，李 鈁，楊 豐

(自然資源部第三海洋研究所、海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005)

在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究中，細(xì)胞數(shù)量是一個(gè)常用的生理指標(biāo)。例如，在人類疾病研究中，血細(xì)胞數(shù)量被用作貧血和炎癥的指標(biāo)[1]，血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目[2]和浸潤在組織中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目[3]被作為癌癥檢測的重要指標(biāo)。在微生物研究中，藻類[4]和細(xì)菌[5]的數(shù)量被作為環(huán)境監(jiān)測指標(biāo)。而在水產(chǎn)動(dòng)物的研究中，循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量是評(píng)估甲殼動(dòng)物[6]、軟體動(dòng)物[7]、魚類[8]等的免疫狀態(tài)的指標(biāo)。

細(xì)胞計(jì)數(shù)的常見方法有直接法和間接法。直接法即直接對細(xì)胞群進(jìn)行計(jì)數(shù)，例如，血球計(jì)數(shù)板法是將細(xì)胞懸液滴在劃有方格的玻璃上通過鏡檢計(jì)數(shù)[9]；連續(xù)稀釋法是將菌液稀釋涂布后對單菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)[10]；電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是基于庫爾特計(jì)數(shù)原理，在細(xì)胞通過充滿電解質(zhì)的測定管后，根據(jù)電阻的變化計(jì)算細(xì)胞直徑，最后統(tǒng)計(jì)出給定大小的細(xì)胞數(shù)目[11]；流式細(xì)胞儀可以將單個(gè)細(xì)胞一一分開分別測定熒光值等指標(biāo)并進(jìn)行計(jì)數(shù)[12]。間接法中，可以根據(jù)菌液濁度估算細(xì)胞數(shù)量[9]；MTT法利用3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]被活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶氧化為藍(lán)色的甲臜，再加入二甲基亞砜(DMSO)溶解并測定其光吸收值來估算活細(xì)胞數(shù)量[13]。雖然細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法種類繁多，但是上述方法均不適合用于直接測定實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)。對于實(shí)體組織而言，通常需要利用膠原酶[14]、胰蛋白酶[15]，或纖維素酶[16]等將塊狀組織消化為單細(xì)胞懸液再進(jìn)行計(jì)數(shù)，而這個(gè)方法也并不適用于所有實(shí)體組織，且操作繁瑣，組織消化的充分程度直接影響準(zhǔn)確性。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time Fluorescence Quantitative PCR， qPCR)可用于定量分析特定基因的拷貝數(shù)[17]，因此，這一方法被廣泛用于病毒[18]、細(xì)菌[19]等微生物數(shù)量的測定。雖然這個(gè)方法較少用于動(dòng)植物細(xì)胞計(jì)數(shù)，但確有學(xué)者通過qPCR檢測特定基因來評(píng)估血液和組織中某些特殊的細(xì)胞的含量[20]。

在對螯蝦、對蝦、蟹類等養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物的研究中，研究者多以實(shí)體組織的整體為單位來評(píng)價(jià)病原的感染增殖或分析宿主和病原基因的表達(dá)。實(shí)際上不同組織的細(xì)胞含量存在較大差異，因此，在進(jìn)行組織間比較時(shí)，整體組織水平的檢測無法完全反映單細(xì)胞水平的情況。此外，病原感染、外傷等外界刺激也有可能引起實(shí)體組織中細(xì)胞數(shù)量的改變，目前尚未有合適的方法對此進(jìn)行定量分析。

本研究建立了基于基因拷貝數(shù)的紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)細(xì)胞數(shù)量測定方法。該方法以beta-actin基因?yàn)槟繕?biāo)基因，以已知數(shù)量的血細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)樣，通過qPCR測定實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)量，具有方便快捷和高通量的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

紅螯螯蝦購自汕頭紀(jì)雄水產(chǎn)有限公司，飼養(yǎng)于25 ℃左右環(huán)境中，隔天喂食換水，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)一個(gè)月左右，檢測未見蝦類常見病原。

1.2 基因克隆和測序

根據(jù)beta-actin(GenBank登錄號(hào): MN396754.1)和GAPDH(GenBank登錄號(hào): KM538172.1)兩個(gè)基因的mRNA序列設(shè)計(jì)引物(表1)。使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取螯蝦鰓組織DNA。使用Takara公司的PrimeSTAR HS試劑盒進(jìn)行PCR。PCR程序設(shè)置為98 ℃變性15 s，55 ℃/58 ℃(GAPDH/beta-actin)退火5 s，72 ℃延伸120 s，共25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，明亮的條帶切膠回收后委托鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 qPCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)所獲得的兩個(gè)基因的DNA序列，設(shè)計(jì)qPCR引物(表1)，使一對引物中的一條位于內(nèi)含子區(qū)，一條位于外顯子區(qū)。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.4 樣品制備

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備 取3只紅螯螯蝦，分別抽取約2 mL血淋巴；用Orfol公司的Moxi Z細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定血細(xì)胞數(shù)目。從每一份樣品中取5×106個(gè)血細(xì)胞，按“1.2”所述方法提取基因組DNA。然后取相當(dāng)于1×105、1×104、1×103、1×102、1×10個(gè)血細(xì)胞的DNA樣品作為qPCR的標(biāo)準(zhǔn)模板，共有來源于3只不同螯蝦的3組樣品。

1.4.2 待測樣品制備 取10 mg鰓或肝胰腺組織，按“1.2”所述方法提取基因組DNA，產(chǎn)物用100 μL無菌水溶解，取2 μL (相當(dāng)于0.2 mg組織的DNA)作為qPCR模板。

1.5 qPCR(染料法)

使用TOYOBO的SYBR? Green Realtime PCR Master Mix試劑盒和Applied Biosystems StepOneTMqPCR儀。反應(yīng)體系中含DNA模板2 μL，正反向引物(10 μmol/L) 各1 μL，去離子水6 μL，PCR預(yù)混液10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.6 擴(kuò)增效率分析

取3只紅螯螯蝦，按“1.4”所述方法分別制備血細(xì)胞、鰓和肝胰腺組織的基因組DNA樣品。取相當(dāng)于1×105個(gè)血細(xì)胞，或者相當(dāng)于0.2 mg鰓和肝胰腺組織的基因組DNA。每個(gè)樣品制備成：原濃度、10倍稀釋、100倍稀釋、1 000倍稀釋共4個(gè)梯度。對上述樣品進(jìn)行beta-actin基因的qPCR檢測，獲得Ct值，并計(jì)算擴(kuò)增效率和擬合優(yōu)度(R2)。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因克隆

通常來說，基因組拷貝數(shù)在同一物種不同組織的體細(xì)胞中是相同的，處于有絲分裂S、 G2、 M期、染色體倍性異常的細(xì)胞，以及多核細(xì)胞等特殊情況除外。因此，通常同等數(shù)量的不同組織細(xì)胞，其某個(gè)基因的拷貝數(shù)是一致的，可以通過對基因的定量來測算細(xì)胞數(shù)。我們選擇了GAPDH、beta-actin這兩個(gè)常見的看家基因作為目標(biāo)基因，根據(jù)其mRNA序列設(shè)計(jì)了引物(表1)。用紅螯螯蝦鰓組織的基因組DNA作為模板分別擴(kuò)增這兩個(gè)基因的DNA序列，均得到了清晰明亮的單一條帶。GAPDH的PCR產(chǎn)物長度約為2 000 bp，beta-actin的PCR產(chǎn)物長度在1 000～2 000 bp之間(圖1)。測序結(jié)果表明GAPDH基因片段長度為2 066 bp (GenBank登錄號(hào): MN918114.1)，beta-actin基因片段長度為1 641 bp(GenBank登錄號(hào): MN918115.1)，與瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果相符。我們將兩個(gè)基因片段與對應(yīng)的mRNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)兩種基因的序列中各含一個(gè)內(nèi)含子，其中GAPDH的內(nèi)含子長654 bp，beta-actin的內(nèi)含子長191 bp。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis analysis of PCR productsM：分子量標(biāo)準(zhǔn)； a： beta-actin； b： GAPDH。

2.2 qPCR的引物設(shè)計(jì)和熔解曲線分析

根據(jù)獲得的GAPDH和beta-actin基因片段設(shè)計(jì)qPCR引物(表1)，其中一條設(shè)計(jì)在外顯子區(qū)，另一條設(shè)計(jì)在內(nèi)含子區(qū)，使其僅能以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。其中GAPDH的qPCR產(chǎn)物長100 bp，beta-actin的qPCR產(chǎn)物長56 bp。進(jìn)一步以多個(gè)血細(xì)胞和鰓組織的基因組DNA樣本為模板，對兩個(gè)基因qPCR的熔解曲線進(jìn)行檢測，結(jié)果表明GAPDH的熔解曲線存在雜峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物不均一；而beta-actin的熔解曲線呈現(xiàn)出單峰，沒有非特異性擴(kuò)增，效果較好(圖2)。因此我們選用beta-actin作為qPCR的目標(biāo)基因。

2.3 beta-actin基因在不同組織中的擴(kuò)增效率分析

血細(xì)胞是均勻分散的單個(gè)細(xì)胞，可以采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)。成熟血細(xì)胞不具有分裂能力[21]，基因組DNA不復(fù)制，因此其目標(biāo)基因的含量可以直接與細(xì)胞數(shù)量對應(yīng)。所以，本研究選擇血細(xì)胞作為細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品；以血細(xì)胞數(shù)目為基準(zhǔn)，用qPCR相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法測算實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)目。在qPCR中，擴(kuò)增效率對于實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。因此，我們以梯度稀釋的鰓、肝胰腺和血細(xì)胞的基因組DNA為模板，測算了beta-actin基因的qPCR擴(kuò)增效率。結(jié)果顯示，以3種組織的基因組DNA為模板，beta-actin基因的擴(kuò)增效率均達(dá)到qPCR要求的90%～110%范圍[22]，擴(kuò)增效率基本一致(表2)。因此，利用血細(xì)胞樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠用于測算其他組織的細(xì)胞含量。

2.4 利用qPCR進(jìn)行實(shí)體組織細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取3只紅螯螯蝦，分別抽取約2 mL血淋巴，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定血細(xì)胞數(shù)目，提取基因組DNA。取相當(dāng)于1×105、1×104、1×103、1×102、1×10個(gè)血細(xì)胞的DNA樣品作為標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行beta-actin基因的qPCR分析。以血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品的細(xì)胞數(shù)對數(shù)值和所對應(yīng)的Ct值作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，不同批次樣品之間的重復(fù)性良好；在測試范圍內(nèi)(1×10～1×105個(gè)細(xì)胞)，qPCR的Ct值與細(xì)胞數(shù)的對數(shù)之間呈良好的線性關(guān)系，線性回歸得到回歸曲線(圖3)和回歸方程Ct=38.30-3.37 lg (N)，其中，N是細(xì)胞數(shù)量。此外，測得R2=0.992，擴(kuò)增效率為97.74%。

圖2 qPCR熔解曲線Fig. 2 qPCR melt curves縱坐標(biāo)中F為熒光強(qiáng)度，T為溫度。

表2 不同組織樣品的qPCR擴(kuò)增效率分析Tab. 2 qPCR amplification efficiency analysis with different tissue samples

圖3 qPCR組織細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 qPCR standard curve of cell counting

2.4.2 實(shí)體組織的細(xì)胞計(jì)數(shù) 取3只螯蝦，分別取10 mg鰓組織和肝胰腺組織，提取基因組DNA。隨后每個(gè)樣品取相當(dāng)于0.2 mg 組織的DNA作為模板進(jìn)行beta-actin基因的qPCR分析。測得0.2 mg鰓組織樣品對應(yīng)的Ct值為22.65～22.96，根據(jù)上述公式計(jì)算可得細(xì)胞數(shù)為3.6×104～4.4×104；0.2 mg肝胰腺組織的Ct值為21.21～21.29，計(jì)算可得細(xì)胞數(shù)為1.1×105～1.2×105。所以鰓組織中平均細(xì)胞含量約為2.0×105個(gè)細(xì)胞/mg，肝胰腺組織中平均細(xì)胞含量約為5.8×105個(gè)細(xì)胞/mg，說明不同組織的細(xì)胞含量存在明顯差異，相同質(zhì)量的鰓組織中的細(xì)胞數(shù)目較少，而肝胰腺組織的細(xì)胞數(shù)較多。而同一組織不同樣本之間的差異較少，鰓組織在1.8×105～2.2×105個(gè)細(xì)胞/mg之間，肝胰腺組織在5.5×105～6.0×105個(gè)細(xì)胞/mg之間。上述結(jié)果表明qPCR相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法能夠有效地測算實(shí)體組織的細(xì)胞數(shù)目(表3)。

2.5 討論

本研究建立了基于基因拷貝數(shù)和qPCR的實(shí)體組織細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。利用這一方法，首先可以定量分析螯蝦不同組織在細(xì)胞含量上的差異，加深對不同組織結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。其次，在對養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物病毒性疾病的研究中，研究者多以實(shí)體組織的整體為單位來評(píng)價(jià)病毒的組織特異性，比較在不同組織中的增殖效率。而病毒是在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖的，同等質(zhì)量的不同組織細(xì)胞含量存在差異。因此以組織質(zhì)量為單位來衡量病毒在某種細(xì)胞中的增殖情況存在一定的不足。通過對特定組織中的病毒量和細(xì)胞數(shù)的定量分析，可以得出平均每個(gè)細(xì)胞的病毒載量，能夠更準(zhǔn)確的了解病毒對不同組織細(xì)胞的嗜性。再次，研究者在分析宿主基因表達(dá)的時(shí)候，也往往以表達(dá)量與組織質(zhì)量的比值作為指標(biāo)。通過對目標(biāo)組織進(jìn)行定量，可以使我們對不同組織基因表達(dá)分析的精度提高到細(xì)胞水平，提升了組織間基因表達(dá)橫向比較的維度。此外，研究表明，甲殼動(dòng)物血細(xì)胞數(shù)量會(huì)受到病原感染、蛻殼周期，晝夜節(jié)律等的影響。實(shí)體組織中的細(xì)胞含量(特別是像鰓這樣包含了許多血細(xì)胞的實(shí)體組織)，是否也有可能會(huì)受到上述因素的影響目前尚未可知。本研究所建立的方法為探究這一問題提供了技術(shù)手段。

表3 鰓和肝胰腺組織細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Tab. 3 Cell count results of gill and hepatopancreas

利用本研究所建立的方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，需要注意以下幾點(diǎn)：①實(shí)驗(yàn)中所取的樣品量直接影響計(jì)數(shù)結(jié)果，因此每個(gè)組織至少需要取3個(gè)平行樣品以減小取樣不均造成的誤差。②不同基因組DNA提取試劑盒的提取效率不同，在實(shí)驗(yàn)過程中盡量選擇同一種試劑盒。此外，在DNA稀釋的過程中需盡量準(zhǔn)確，避免操作誤差。③qPCR過程中，標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增效率極為重要，首先要保證待測組織和血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率相近，才能對待測組織進(jìn)行測算。如果對于細(xì)胞數(shù)目的測定精度要求較高，可以考慮增加參考基因數(shù)目。除了本實(shí)驗(yàn)提供的beta-actin基因，還可設(shè)計(jì)2～3對其他基因的跨內(nèi)含子、外顯子引物，使用多個(gè)基因進(jìn)行校準(zhǔn)。④由于本方法是基于基因拷貝數(shù)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，因此對處于有絲分裂期的細(xì)胞的測算會(huì)存在一定的偏差。如果組織中處于S和M期的細(xì)胞比例較高，需要根據(jù)比例對細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行一定的校正。此外，多核細(xì)胞無法用本法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究建立了基于基因拷貝數(shù)和qPCR的螯蝦實(shí)體組織細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。根據(jù)螯蝦成熟血細(xì)胞不能增殖，且其單細(xì)胞懸液可以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的特點(diǎn)，選取已知數(shù)量的血細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)樣。通過熔解曲線分析，選擇了beta-actin基因作為目標(biāo)基因。利用血細(xì)胞基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行beta-actin基因的qPCR分析；基于細(xì)胞數(shù)和Ct值繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出了細(xì)胞數(shù)量與Ct值的換算公式。并利用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法成功測定了鰓組織和肝胰腺組織的細(xì)胞數(shù)目。該方法具有簡單便捷的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對實(shí)體組織細(xì)胞數(shù)量的高通量測定。