海南新村灣海草促生菌株分離及多樣性

林顯程，董俊德，周衛(wèi)國，彭秋穎，張 健，張 穎，楊清松，唐小玉，張燕英，凌 娟*

(1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所、中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室、廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510301； 2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室，廣東 廣州 510301；3.中國科學(xué)院海南熱帶海洋生物重點實驗站，海南 三亞 572000；4. 中國科學(xué)院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510301； 5. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

海草床作為生物多樣性和生產(chǎn)力最高的海洋生態(tài)系統(tǒng)之一，為海洋生物提供了棲息地和食物來源，并參與到碳、氮、磷和硫等的生物地球化學(xué)循環(huán)，具有重要的生態(tài)服務(wù)功能[1]。海草的生長極易受到氮、磷等營養(yǎng)元素的限制，但其根際和葉際共附生大量對宿主有益的微生物[2-5]，能將氮氣和不溶性磷轉(zhuǎn)化為銨鹽和可溶性無機磷供海草吸收利用。此類細菌一般為植物促生菌(Plant Grouth Promoting Bauteria, PGPB)，是一類具有促進植物生長、提高植物營養(yǎng)吸收效率和提高植物抗逆性的益生菌群，主要為植物內(nèi)生菌、根際和葉際附生微生物[6]。PGPB可以通過直接或間接的途徑來維持植物的健康生長[7]。間接途徑一般是指促生菌通過分泌抗生素、蛋白酶等來幫助宿主植物抵抗病原微生物的入侵，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生有效的系統(tǒng)抗性[7-10]。PGPB的直接作用主要包括合成植物激素和促進植物營養(yǎng)物質(zhì)吸收。如促生菌可通過分泌吲哚乙酸(IAA)、細胞分裂素(CTK)和赤霉素(GA)等植物激素刺激植物生長，也可通過釋放磷酸鹽和硅酸鹽等礦物質(zhì)中的磷和鉀，直接提高植物可吸收營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。

在農(nóng)業(yè)上，PGPB已經(jīng)作為微生物菌劑開發(fā)利用，能有效減少化學(xué)肥料的應(yīng)用、改善鹽堿地，幫助農(nóng)作物對抗干旱、重金屬污染和病原菌入侵[11-12]。陳倩等(2011)發(fā)現(xiàn)固氮菌Paenibacillussp. 能拮抗小麥和棉花病原真菌，并使小白菜增重52%[13]；Patel等(2017)發(fā)現(xiàn)內(nèi)生固氮菌能在小麥根內(nèi)定殖，并能顯著增加小麥鮮重、干重、根長、葉長和促進其光合作用[14]；葡萄糖酸桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)能緩解干旱脅迫，提高水稻產(chǎn)量和抗性[15]。PGPB作為農(nóng)業(yè)益生菌劑的研究在國內(nèi)外趨于成熟，但在海草研究領(lǐng)域還是一片空白，國內(nèi)關(guān)于海草益生菌的分離培養(yǎng)及多樣性也鮮有報道[16-18]。20世紀以來，由于人類活動和氣候變化的影響，全球范圍內(nèi)的海草床正以每年7%的速率發(fā)生退化，導(dǎo)致海草床生態(tài)服務(wù)功能受到損害[1]，如海草床捕獲的碳以每年299 Tg的速率重新釋放[2]。海草植株移植是目前修復(fù)海草床的主要方法之一[19]，但是移植后海草植株需要一段時間來形成穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，本研究擬通過富集培養(yǎng)和促生特性分析方法篩選出合適的海草促生菌，未來研制成微生物菌劑作用于移植海草根際，為植株提供N、P和Fe等營養(yǎng)物質(zhì)并提高其適應(yīng)性，對海草床生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

采樣地新村灣(18°24′34″N，109°57′42″E)位于我國海南省陵水縣，其西部與南海相接，為天然瀉湖，優(yōu)勢海草種類為泰來草(Thalassiahemperichii)和海菖蒲(Enhalusacoroides)。用無菌鏟獲得泰來草和海菖蒲的植株及根際沉積物，分裝于無菌袋中，立即帶回實驗室處理。用無菌海水沖洗海草植株，將葉子和根分開。取0.5 g沖洗干凈并剪碎的海草葉子或根、0.2 g根際沉積物，分別放入18 mL無菌海水中搖勻，稀釋成1×10-1和1×10-22個梯度，直接涂布于固氮菌篩選固體培養(yǎng)基中；取2 g泰來草或海菖蒲根際沉積物至98 mL選擇性液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min的培養(yǎng)條件于搖床中富集培養(yǎng)，3 、15 d和30 d后分別取混懸液稀釋至一定濃度涂布于選擇性固體培養(yǎng)基中。

1.2 培養(yǎng)基

海草固氮培養(yǎng)基[20]：NaCl 25 g， MgSO4· 7H2O 4.8 g， MgCl2· 6H2O 4.0 g，蛋白胨 4.0 g，酵母提取物 2.0 g， KCl 0.56 g， Tris 0.48 g， K2HPO40.01 g， FeSO4· 7H2O 0.001 g，甘油 2.0 mL，去離子水1 L，pH為 8.2，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。

Ashby無氮培養(yǎng)基[20]：D-甘露醇 5.0 g， NaCl 5.0 g， CaCO35.0 g， KH2PO4·H2O 0.2 g， MgSO4·7H2O 0.2 g， CaSO40.1 g，去離子水 1 L，pH為 7.0，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。用于固氮菌的篩選。

改良選擇性解磷培養(yǎng)基(PSM)[21]：D-葡萄糖 15.0 g， NaCl 25 g， NH4NO35.0 g， CaCl22.0 g， KCl 0.5 g， MgSO4·7H2O 0.5 g， FeSO4·7H2O 0.01 g， MnSO4·7H2O 0.01 g，植酸鈉 4 g(用少量水溶解，單獨滅菌)，去離子水 1 L，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。用于溶磷菌篩選。

2216E液體培養(yǎng)基：購于青島海博生物科技有限公司，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。用于細菌純化后的傳代培養(yǎng)、菌種保藏及促生能力驗證。

1.3 細菌DNA提取及PCR擴增

劃線純化后的菌株用試劑盒Bacterial DNA Kit(OMEGA)提取基因組DNA。引物27F(5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)用來擴增16S rRNA基因，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰的送廣州天一輝遠基因科技有限公司進行測序。細菌16S rRNA基因序列導(dǎo)入EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)進行比對。

1.4 促生特性測定

1.4.1 固氮能力檢測 引物nifHF(5′-ATGTCGGYTGYGAYCCSAARGC-3′)和nifHR(5′-ATGGTGTTGGCGGCRTAVAKSGCCATCAT-3′)用來擴增固氮基因[22]，并用乙炔(C2H4)還原法測定菌株固氮酶活性[23]。固氮菌株在裝有2216E液體培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中搖瓶生長至對數(shù)期，隨即轉(zhuǎn)移到帶有密封塞的小氣瓶中，用注射器抽出5%的空氣，同時打入等體積的純乙炔，反應(yīng)24 h，用GC112A氣相色譜儀檢測乙烯和乙炔峰。用不同體積濃度的純標準乙烯氣體和乙烯峰面積制作標準曲線，R2>0.99。

1.4.2 菌株溶磷活性檢測 采用鉬銻抗比色法測菌株溶磷能力[24]。接種1%活化后的待測菌液(OD值為0.6)至20 mL改良選擇性PSM培養(yǎng)基中，置于搖床中28 ℃，160 r/min培養(yǎng)5 d，空白PSM培養(yǎng)基為對照。取1 mL發(fā)酵液于4 000 r/min離心30 min，吸取200 μL上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶，滴加二硝基酚指示劑，調(diào)節(jié)pH至溶液微黃，加入5 mL鉬銻抗顯色劑，搖勻定容。靜置4 h后于886 nm處測定吸光度。根據(jù)制定的標準曲線計算溶磷量，R2>0.99。

1.4.3 菌株產(chǎn)鐵載體測定 菌株產(chǎn)鐵載體能力用CAS固體平板法檢測[25]。先將待測菌株于2216E固體培養(yǎng)基上活化，用鉑金絲挑起單菌落接種在CAS固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)橙黃色暈圈。一般暈圈越大、顏色越深，菌株產(chǎn)鐵載體能力越強。

1.4.4 菌株蛋白氨化能力測定 將活化后的菌株接種到裝有10 mL蛋白胨溶液(蛋白胨10 g/L，NaCl 25 g/L)的25 mL錐形瓶中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，每瓶加入0.5 mL Nessler試劑(阿拉丁，上海)，菌液顏色由黃色轉(zhuǎn)為橙色說明菌株具有氨化能力[25]。

1.4.5 菌株產(chǎn)IAA能力測定 菌株產(chǎn)IAA能力用Salkowski顯色反應(yīng)檢測[26]。細菌在添加了L-色氨酸(終濃度為200 μg/mL)的2216E液體培養(yǎng)基中28 ℃搖瓶培養(yǎng)3 d，取2 mL培養(yǎng)液10 000 r/min離心15 min，小心吸取1 mL上清液與2 mL Salkowski顯色液(50 mL 35%高氯酸與1 mL 0.5% FeCl3溶液混合)混勻，在室溫下暗反應(yīng)30 min，測OD530。以IAA標準品(Sigma)梯度稀釋液作標準曲線，空白培養(yǎng)基作對照，R2>0.99。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2016整理數(shù)據(jù)和制作標準曲線，用Mothur軟件對樣品進行細菌多樣性分析，包括OTU(Operational Taxonomic Unit)數(shù)目、Chao、 Shannon和Simpson指數(shù)。其中，Chao指數(shù)代表物種豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)代表物種均勻度和多樣性[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 泰來草和海菖蒲獲得菌株初步鑒定及多樣性

通過直接稀釋涂布法和富集培養(yǎng)法分離篩選，初步從泰來草和海菖蒲根、葉和根際沉積物中分離純化出可培養(yǎng)細菌131株，隸屬于36屬61種，芽孢桿菌(Bacillus)、弧菌(Vibrio)和希瓦氏菌(Shewanella)為優(yōu)勢屬，分別占14.50%、10.69%和8.49%。獲得菌株中有74株分離自泰來草，占27個屬，13個屬為其特有；海菖蒲有23個屬，9個屬為其特有。芽孢桿菌和弧菌同樣在兩種海草中占優(yōu)勢(表1、圖 1)；兩種固氮菌選擇性培養(yǎng)基分離獲得菌株111株，而只有20株菌分離自溶磷培養(yǎng)基(表1)?；诩毦鄻有苑治觯﹣聿輼悠稯TU數(shù)目、Chao和Shannon指數(shù)均高于海菖蒲樣品，表明泰來草分離細菌多樣性高于海菖蒲(表2)；三種培養(yǎng)基中，PSM培養(yǎng)基獲得OTU數(shù)目最少，多樣性最低，而海草固氮培養(yǎng)基Chao指數(shù)最高，多樣性指數(shù)略高于Ashby培養(yǎng)基。

表1 兩種海草分離篩選菌株來源及分布Tab. 1 Source and distribution of the isolated strainson two seagrasses

圖1 泰來草和海菖蒲中分離獲得菌株在屬水平上的組成Fig. 1 Composition of isolated strains in genus level on seagrass T. hemperichii and E. acoroides

表2 不同海草和培養(yǎng)基分離細菌的多樣性指數(shù)Tab. 2 Diversity index of bacteria isolated from different seagrass species and mediums

2.2 菌株促生特性驗證

2.2.1 菌株固氮能力 僅12株菌能擴增出固氮基因，主要包括弧菌、交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)、Breoghania、Oricola和Salipiger5個屬。經(jīng)測定，菌株L-2(Breoghaniacorrubedonensis)以 C2H4計的固氮酶活性達14.27 nmol/(h·mL) 。

2.2.2 菌株溶解無機磷能力 共17株菌在PSM培養(yǎng)基上有明顯溶磷圈，基于16S rRNA鑒定主要來自3個種：新加坡克雷伯氏菌(Klebsiellasingaporensis)、解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)和阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)。經(jīng)鉬銻抗比色法測定，代表菌株XHP-1(K.singaporensis)、XTP-5-1(B.aryabhattai)和XTP-9(R.ornithinolytica)的溶磷量分別為29.92、14.30、44.86 mg/L，溶解無機磷能力較強(圖2)。

圖2 部分菌株在PSM培養(yǎng)基上產(chǎn)生的溶磷圈Fig. 2 Phosphate dissolving rings produced on PSM medium by some isolated strains

2.2.3 菌株產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA和蛋白氨化能力 根據(jù)CAS固體平板上暈圈的大小和顏色深淺判斷菌株產(chǎn)鐵載體的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分細菌都產(chǎn)鐵載體，但有27株細菌產(chǎn)鐵載體能力較弱，占總菌株數(shù)的44%。另外，只有RS-8、 XTP-5-1、 XTP-9、 XTP-11、 XTN-1和XTN-7這6株菌的產(chǎn)鐵載體能力為“+++”(圖3)，分別屬于貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、阿氏芽孢桿菌(B.aryabhattai)、解鳥氨酸拉烏爾菌、嗜絲氨酸副球菌(Paracoccusseriniphilus)、需鈉弧菌(Vibrioneocaledonicus)和希瓦氏菌屬(Shewanellacarassii)。通過觀察顯色反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，約49%的供試菌(30株)不具有蛋白氨化能力，有9株菌的氨化能力較弱，而弧菌、希瓦氏菌和芽孢桿菌氨化能力最強。經(jīng)Salkowski法測定，有41株菌產(chǎn)吲哚乙酸能力較弱(<10 μg/mL)或不產(chǎn)，10株菌吲哚乙酸產(chǎn)量大于50 μg/mL，其中7株菌的產(chǎn)量在113.69～179.48 μg/mL之間，具有較強的產(chǎn)IAA能力，主要為弧菌、克雷伯氏菌和芽孢桿菌(表3)。

圖3 高產(chǎn)鐵載體的菌株Fig. 3 Strains with high siderophore yielding ability

表3 潛在海草促生菌株促生特性分析結(jié)果Tab. 3 Results of growth-promoting traits of potential PGPB strains

2.3 根際促生菌系統(tǒng)發(fā)育分析

結(jié)合固氮活性、溶磷活性及其他促生特性分析，菌株L-2、 XTA-9、 XHP-1、 XTP-5-1和XTP-9至少有3種或以上，促生能力較強，適合作為海草根際促生菌使用(表3)。對5株菌進行16S rRNA基因擴增，并在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行同源比對，下載序列相似性最高的參考菌株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，L-2、XHP-1、XTP-9分別與BreoghaniacorrubedonensisUBF-P1、新加坡克雷伯氏菌、解鳥氨酸拉烏爾菌同源性最高，而XTA-9與巨大芽孢桿菌(BacillusmegateriumNBRC 15308)相似性為99.24%，XTP-5-1與阿氏芽孢桿菌相似性為99.96%。

圖4 潛在海草促生菌株基于鄰建法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of potential seagrass growth-promoting bacteria by Neighbor-Joining method

2.4 討論

海草的健康生長和較高的生產(chǎn)力得益于與微生物的共生關(guān)系[4,7,28-30]。海草植株通過改變分泌物招募有益微生物，而促生菌可以為海草解除營養(yǎng)限制并減少毒害作用。Crump等(2018)證實鰻草(Zosteramarina)和日本鰻草(Z.japomica)根際及葉際共附生細菌群落中存在豐富的硫氧化還原、固氮和植物激素基因，對維持海草生長有重要作用[4]。本研究利用固氮和溶磷選擇性培養(yǎng)基，通過富集培養(yǎng)的方法篩選海南新村灣優(yōu)勢海草泰來草和海菖蒲潛在促生菌，共獲得細菌131株，分布于36屬61種。泰來草和海菖蒲優(yōu)勢屬均為芽孢桿菌和弧菌，但泰來草樣品獲得了74株菌和36個OTU，而海菖蒲樣品只有57株菌和29個OTU，前者細菌多樣性明顯高于后者。Jiang等(2015)同樣發(fā)現(xiàn)新村灣泰來草可培養(yǎng)細菌豐度高于海菖蒲[17]，優(yōu)勢目為芽孢桿菌目，這與我們的研究一致。另外，雖然海草固氮培養(yǎng)基的細菌多樣性高于Ashby和PSM培養(yǎng)基，但5株潛在促生菌中有4株來自Ashby和PSM培養(yǎng)基(XHP-1、 XTP-9、 XTP-5-1和 XTA-9)，說明選擇性更強的Ashby和PSM培養(yǎng)基更容易分離到功能菌株。

芽孢桿菌、假單胞菌、根瘤菌(Rhizobium)、伯克氏菌(Burkholderia)和克雷伯氏菌等是國內(nèi)外研究廣泛報道的植物根際促生菌，普遍具有溶磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA和ACC脫氨酶活性等促生能力和生物防治作用[31]。本研究獲得5株促生能力較強的菌株，通過擴增16S rRNA基因鑒定分別為Breoghania(L-2)、克雷伯氏菌(XHP-1)、拉烏爾菌(XTP-9)和芽孢桿菌(XTA-9和XTP-5-1)。兩株芽孢桿菌XTA-9和XTP-5-1在16S rRNA基因比對上分別與巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌相似性最高。Liu等(2006)篩選到一株固氮巨大芽孢桿菌C4，用gfp基因標記發(fā)現(xiàn)它能很好地定植在水稻和玉米根部[32]；吉玉玉等(2019)發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌粗提物能有效抑制根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)等病原菌，主要抑菌成分為亞油酸和亞油酸甲酯等[33]。Park等(2017)用產(chǎn)植物激素的阿氏芽孢桿菌處理大豆植株，結(jié)果顯示其顯著提高了大豆產(chǎn)IAA、GA和茉莉酸(JA)的水平，并提高了大豆熱耐受能力[34]?？死撞暇瑯泳哂卸喾N的促生特性，大部分為溶磷菌，可產(chǎn)植物激素，并能拮抗有害重金屬[35-37]。此外，Klebsiellavariicola和Klebsiellapneumoniae是報道最廣泛固氮菌[37-38]，常作為氮循環(huán)模型研究。Drancourt等(2001)將拉烏爾菌從克雷伯氏菌中獨立出來，歸為一個新屬，但拉烏爾菌和克雷伯氏菌具有相似的促生特性，同樣具有溶磷、固氮和產(chǎn)植物激素能力[39]。Guo等(2015)發(fā)現(xiàn)添加K.variicola、Raoultellaplanticola或Pseudomonasfluorescens均使玉米積累膽堿和甜菜堿，從而增加玉米葉水分含量和干重，使得玉米植株對干旱耐受增加[40]。菌株B.corrubedonensis屬于粘著桿菌科首次從以多環(huán)芳烴芘為唯一碳源的培養(yǎng)物中分離獲得，能有效降解石油[41]。本研究分離純化的菌株L-2與B.corrubedonensis相似性為98.89%，具有固氮能力，IAA產(chǎn)量達93.46 μg/mL，并且還具有產(chǎn)鐵載體和氨化能力，具有作為PGPB的巨大潛力。

作為極其脆弱的生態(tài)系統(tǒng)，海草床和珊瑚礁、紅樹林生態(tài)系統(tǒng)一樣，容易受到人類活動和自然環(huán)境變化的影響。海草移植，即從茂盛、健康的海草床中采集植株移栽到待修復(fù)的區(qū)域里，是海草床生態(tài)修復(fù)的有效手段。劉燕山等(2015)移植到山東榮成天鵝湖的鰻草植株存活率達76.5%以上，定植時間為1～4個月不等[42]。研究表明，增加營養(yǎng)鹽能增加移植海草的根長、葉長及生物量[43-44]，而潛在的促生菌正好能提供這些營養(yǎng)物質(zhì)。例如，固氮菌可以將海草不能直接利用的氮氣轉(zhuǎn)化為銨鹽，為海草床提供“新氮源”，溶磷菌通過產(chǎn)植酸酶釋放可溶性無機鹽，而吲哚乙酸可以刺激海草細胞分裂，促進根和葉的伸長。Xiong等(2017)發(fā)現(xiàn)施加以芽孢桿菌和木霉菌(Trichoderma)為主的微生物菌劑能夠明顯抑制玉米鐮刀枯萎病的發(fā)生，其抑菌機制是通過微生物菌劑改善植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)，招募能直接抑制病原菌的細菌Lysobacter[45]。這說明PGPB具有改變宿主植物微生物群落結(jié)構(gòu)的能力，使微生物群落朝著有利于宿主生長的方向演變。因此，促生菌的添加不僅能直接增加移植海草可用營養(yǎng)鹽含量，并且有可能幫助移植海草在短時間內(nèi)重塑附生微生物群落結(jié)構(gòu)，使其更好地在新環(huán)境中定植生長，有利于海草生態(tài)系統(tǒng)的保護和修復(fù)。

3 結(jié)論

通過溶選擇性磷和固氮培養(yǎng)基的篩選，本研究一共從海南新村灣兩種優(yōu)勢海草的根、葉和根際沉積物中獲得細菌131株，其中芽孢桿菌、弧菌和假單胞菌為優(yōu)勢屬。在可培養(yǎng)細菌多樣性方面，泰來草>海菖蒲，海草固氮培養(yǎng)基>Ashby培養(yǎng)基>PSM培養(yǎng)基。綜合分析細菌溶磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)吲哚乙酸和蛋白氨化能力，最終篩選出5株潛在促生菌L-2(Breoghaniasp.)、XTA-9(Bacillussp.)、XHP-1(Klebsiellasp.)、XTP-5-1(Bacillussp.)和XTP-9(Raoultellasp.)。其中僅菌株L-2具固氮活性，達14.47 nmol/(h·mL)(以C2H4計)，而XHP-1、 XTP-5-1和XTP-9具有較強的溶磷能力，溶磷量分別為22.92、14.30、44.86 mg/L。另外菌株XTA-9雖然并不表現(xiàn)出固氮和溶磷活性，但具有較強的產(chǎn)IAA和氨化能力。5株菌均具有3種以上的較強的促生能力，是潛在的PGPB，適合進一步研制成微生物菌劑，應(yīng)用于海草植株移植和海草床生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)中。