小分子伴侶對(duì)淀粉樣蛋白β 聚集抑制作用研究

肖 超, 閆 嘯, 關(guān)怡新 , 姚善涇

（1. 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310027;2. Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 01307 Dresden, Germany)

1 前 言

由于生活水平的顯著提高和醫(yī)療條件的普遍改善，人類(lèi)的平均壽命在過(guò)去幾十年中已大幅度增加。然而，隨之而來(lái)的人口老齡化問(wèn)題導(dǎo)致癡呆癥的患病率顯著增加。癡呆癥的主要特征是記憶混亂、人格改變和邏輯受損，在臨床上癡呆癥可能有多種表現(xiàn)形式，但迄今為止最典型的是阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)。據(jù)估計(jì)全世界有4 700 萬(wàn)人受此困擾，占所有癡呆癥患者的60%～80%[1]。AD患者的腦部組織學(xué)切片顯示，淀粉樣蛋白β(amyloid β, Aβ)和過(guò)度磷酸化tau 蛋白的自聚集導(dǎo)致腦細(xì)胞外淀粉樣斑塊的形成，以及胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的積累[2]。淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)經(jīng)β-分泌酶酶切產(chǎn)生的C 末端片段具有99 個(gè)氨基酸，該片段可以被γ-分泌酶進(jìn)一步切割，最終形成2 種主要的淀粉樣蛋白：Aβ40和Aβ42[3]。Aβ40在腦細(xì)胞中含量最為豐富，而Aβ42則更易于聚集，因而后者是淀粉樣斑塊的主要組成成分[4]。研究表明，Aβ 的自聚集會(huì)形成含有交叉β 折疊結(jié)構(gòu)的有序聚集體，聚集體導(dǎo)致神經(jīng)突觸功能紊亂，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)異常[5]，因此抑制Aβ 的聚集被認(rèn)為是AD 的有效治療方法之一。目前，大量關(guān)于抑制劑的研究工作都是圍繞天然藥物分子展開(kāi)的，尤其是多酚類(lèi)小分子受到了人們的廣泛關(guān)注。例如，單寧酸可以顯著降低Aβ 的細(xì)胞毒性，還可以將成熟的Aβ 纖維解聚[6]。其他多酚類(lèi)衍生物，如：姜黃素[7]、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)[8]等，均展示了一定的Aβ聚集抑制作用，而且Aβ 自聚集形成的纖維形貌也發(fā)生了顯著改變，但是可能存在的細(xì)胞毒性及不能有效跨越血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)等問(wèn)題還有待深入研究。

在體外和體內(nèi)，Aβ 存在著數(shù)種寡聚體，從二聚體到三聚體、十二聚體和多聚體不等，其中十二聚體(其相對(duì)分子質(zhì)量為56 000，又稱為Aβ*56)具有獨(dú)立于淀粉樣斑塊而損傷神經(jīng)細(xì)胞的能力[9]。在將記憶受損型Tg2576 小鼠大腦中純化出的Aβ*56 向正常幼鼠給藥后，幼鼠的記憶遭到破壞。有研究指出[10]，并非所有的聚集體都具有高細(xì)胞毒性，如果能夠?qū)⒍拘酝肪奂w(on-pathway aggregates)轉(zhuǎn)變?yōu)榉嵌拘酝肪奂w(off-pathway aggregates)，同樣是一種抑制Aβ42聚集、降低其細(xì)胞毒性的策略。分子伴侶(molecular chaperone)家族是一類(lèi)細(xì)胞固有的蛋白質(zhì)，其作用是與其他蛋白質(zhì)相結(jié)合，穩(wěn)定其構(gòu)象，使之正確折疊至天然結(jié)構(gòu)，并發(fā)揮正常生理功能[11]。在大腸桿菌的分子伴侶體系中，GroEL/GroES 系統(tǒng)是在所有生長(zhǎng)條件下都不可或缺的分子伴侶[12]。小分子伴侶，即GroEL 頂端結(jié)構(gòu)域(191-345 位殘基)，由于其在不需要GroES 和ATP 等輔助因子的協(xié)助下，仍能顯示出結(jié)合蛋白和協(xié)助蛋白質(zhì)復(fù)性的活性[13]，因而在協(xié)助蛋白質(zhì)重折疊方面具有廣泛的應(yīng)用[14]。

鑒于小分子伴侶與目標(biāo)蛋白的結(jié)合主要依賴疏水相互作用[15]，而Aβ 聚集的主要原因在于其17-42位殘基所形成的疏水腔[16]，因而小分子伴侶具有改變Aβ 構(gòu)象，從而抑制Aβ 聚集的能力和潛在的應(yīng)用前景。本研究以文獻(xiàn)報(bào)道的多酚類(lèi)抑制劑(姜黃素、EGCG)作為對(duì)比，考察了部分疏水性藥物分子(布洛芬、槲皮素、核黃素)對(duì)Aβ42的抑制作用，重點(diǎn)研究了小分子伴侶的抑制機(jī)理和細(xì)胞毒性，為多肽和蛋白類(lèi)抑制劑的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料

小分子伴侶(minichaperone 191-345)質(zhì)粒由英國(guó)劍橋大學(xué)Alan R. Fersht 教授惠贈(zèng)，其質(zhì)粒載體為pRSET A(T7 啟動(dòng)子，AMP 抗性標(biāo)記)，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖如圖1 所示。宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21 購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司。Aβ42凍干粉(純度＞95%)購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司，姜黃素(developer grade)購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司，EGCG、槲皮素(純度≥95%)購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞株SH-SY5Y 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司，培養(yǎng)基DMEM/F12(1:1) + 10% FBS + 1% 雙抗，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。其他試劑均為市售生化試劑。

圖1 小分子伴侶pRSET A 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of minichaperone 191-345 pRSET A plasmid

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 小分子伴侶在大腸桿菌中的表達(dá)和純化

小分子伴侶的表達(dá)和純化具體參見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。純化后，用凝膠過(guò)濾色譜法分析其純度，所用儀器為L(zhǎng)C3000 型高效液相色譜儀(CXTH,China)，凝膠色譜柱為T(mén)SK-GEL G2000SWXL(Tosoh Bioscience，Japan)。具體地，上樣量為20 μL，流動(dòng)相為PBS，流量為0.5 mL·min-1，在215 nm 處測(cè)定其吸光度值。濃度測(cè)定使用Bradford 法，以BSA 作為參比蛋白計(jì)算得到小分子伴侶蛋白濃度。

2.2.2 Aβ42的預(yù)處理

預(yù)處理方法如文獻(xiàn)[18]所述。首先將Aβ42凍干粉轉(zhuǎn)移至溫度為4 ℃冰箱中，待其溫度穩(wěn)定在4 ℃后，以質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1溶解于六氟異丙醇中，冰浴超聲20 min 以分散Aβ42聚集體。隨后將蛋白溶液在4 ℃冰箱中靜置2 h，冷凍干燥得到絮狀A(yù)β42，置于-20 ℃冰箱中保存待用。使用前，將質(zhì)量為5 mg 的Aβ42溶解于4 mL 20 mmol·L-1NaOH 溶液中(Aβ42終濃度為275 μmol·L-1)，冰浴超聲20 min 使之完全溶解，所得母液冰浴備用。使用時(shí)，分別以含不同種類(lèi)、不同濃度抑制劑的PBS 稀釋母液至所需濃度。

2.2.3 硫代硫磺素(thioflavin T，ThT)熒光

非原位ThT 熒光測(cè)定：按照文獻(xiàn)[19]的方法，將上述制備得到的Aβ42溶液置于37 ℃和轉(zhuǎn)速為150 r·min-1搖床中進(jìn)行老化。在不同的時(shí)間(0、4、8、24、48 h)分別吸取100 μL 樣品，加入1 mL、25 μmol·L-1的ThT 溶液(溶劑為PBS)中，混勻后測(cè)定其熒光強(qiáng)度。其中，Aβ42、姜黃素、布洛芬、槲皮素、核黃素和EGCG 的終濃度為25 μmol·L-1，小分子伴侶濃度分別為25 和50 μmol·L-1。所用儀器為F-4500 熒光分光光度計(jì)(Hitachi，Japan)，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為440 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為480 nm，帶寬為5 nm，掃描速度為100 nm·min-1。記錄所得到的掃描數(shù)據(jù)并扣除不含Aβ42的背景。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均重復(fù)3 次，并進(jìn)行誤差分析。

原位ThT 熒光測(cè)定：96 孔板中每孔加入的溶液體積均為220 μL，其中包括20 μL 濃度為275 μmol·L-1的Aβ42母液、90 μL 濃度為122.2 μmol·L-1的ThT 溶液(ThT 和Aβ42的摩爾濃度比為2.0[20])和110 μL 的抑制劑PBS 溶液。其中，Aβ42、姜黃素、EGCG 和槲皮素的終濃度為25 μmol·L-1，小分子伴侶濃度分別為25 和125 μmol·L-1。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)定未添加Aβ42母液為背景組，將每孔所得到的數(shù)據(jù)減去背景后記錄其數(shù)值。酶標(biāo)儀型號(hào)為Spectra Max M2e(Molecular Device，USA)，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為440 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為480 nm，溫度37 ℃，測(cè)量前振蕩混勻30 s，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均重復(fù)3 次，計(jì)算平均值及方差。

2.2.4 透射電鏡

取30 μL 老化24 h 后的Aβ42樣品滴加到300 目的碳支持膜上，用濾紙吸除碳支持膜邊緣多余溶液。隨后，滴加30 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的醋酸雙氧鈾溶液進(jìn)行負(fù)染，觀測(cè)電鏡結(jié)果。所使用儀器為120 kV 透射電子顯微鏡HT-7700(Hitachi, Japan)，對(duì)照組放大標(biāo)尺為200 nm，實(shí)驗(yàn)組放大標(biāo)尺為50 nm。

2.2.5 凝膠過(guò)濾色譜分析

將老化18 h 后的Aβ42溶液取出，于4 ℃和12 000 g 條件下離心15 min。隨后取上清液，測(cè)定其215 nm 處吸光度[20]，通過(guò)對(duì)各蛋白組分流穿的出峰時(shí)間和峰面積的比較，分析Aβ42可溶性組分的分子量組成。使用牛血清白蛋白(BSA，相對(duì)分子質(zhì)量67 000)、溶菌酶(lysozyme，相對(duì)分子質(zhì)量14 300)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)條件同2.2.1 節(jié)小分子伴侶純度測(cè)定。

2.2.6 細(xì)胞毒性

向96 孔板中加入5 000 個(gè)細(xì)胞/孔，添加培養(yǎng)基至總體積為180 μL，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，再向每孔中加入20 μL 老化24 h 的Aβ42樣品，使得Aβ42終濃度為5 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。向每孔中加入20 μL MTT 溶液(5 mg·mL-1，溶劑為PBS)，培養(yǎng)4 h 后，取出96 孔板，離心移除上清液。而后，向每孔加入200 μL DMSO，在37 ℃和100 r·min-1條件下振蕩15 min 使結(jié)晶完全溶解。使用酶標(biāo)儀(MR 550酶標(biāo)儀，Bio-Rad，USA)測(cè)定570 nm 處吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。僅加入PBS 的細(xì)胞存活率定義為100%，每個(gè)點(diǎn)均設(shè)置6 組平行實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均需減去緩沖液背景，并作均一化處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 小分子伴侶的重組表達(dá)及純化

小分子伴侶的重組表達(dá)及純化電泳圖如圖2 所示。小分子伴侶主要存在于破胞上清液中，本實(shí)驗(yàn)中pRSET A 載體表達(dá)的小分子伴侶，在其N(xiāo) 末端含有6×His 純化標(biāo)簽，因而可以使用Ni-NTA 親和層析柱進(jìn)行捕獲和初步分離工作(圖2(a))。為獲得更高純度的小分子伴侶[21]，從而滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求，在鎳柱純化后，洗脫液通過(guò)體積排阻層析柱進(jìn)一步精制，結(jié)果如圖2(b)所示。將純化蛋白使用分析用凝膠過(guò)濾色譜(ana-SEC)進(jìn)行檢測(cè)，表明制備得到的小分子伴侶純度＞99%。使用Bradford 法，測(cè)得小分子伴侶濃度為47.8 mg·mL-1(2.74 mmol·L-1)，產(chǎn)量為230 mg·L-1。

圖2 重組小分子伴侶表達(dá)及純化SDS-PAGE 圖Fig.2 SDS-PAGE of recombinant minichaperone expression and purification

3.2 小分子伴侶對(duì)Aβ42 溶液聚集動(dòng)力學(xué)的影響

圖3 各抑制劑對(duì)Aβ42 的非原位ThT 熒光強(qiáng)度影響Fig.3 Ex situ ThT fluorescence intensity of Aβ42 with different suppressors

圖3為在各種抑制劑存在時(shí)Aβ42非原位ThT 熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢园l(fā)現(xiàn)，姜黃素、EGCG 和槲皮素均表現(xiàn)出對(duì)Aβ42聚集有良好的抑制作用，相較于PBS 組，其在24 h 時(shí)的ThT 熒光強(qiáng)度分別下降了65%、63% 和66%。原位ThT 熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4(a))同樣驗(yàn)證了這3 種分子的顯著抑制作用，對(duì)比未添加抑制劑的Aβ42聚集動(dòng)力學(xué)曲線，抑制劑不僅降低了熒光響應(yīng)值，同時(shí)也使得聚集到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間大大縮短。然而，小分子伴侶的抑制行為則比較復(fù)雜，對(duì)比圖3 和圖4(b)，兩者的熒光響應(yīng)值表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，非原位ThT 熒光結(jié)果并未表現(xiàn)出與對(duì)照組間的顯著差異；而原位ThT 實(shí)驗(yàn)中，在老化16 h 且小分子伴侶和Aβ42的摩爾比為5:1 (小分子伴侶濃度為125 μmol·L-1)時(shí)，熒光響應(yīng)值相較于對(duì)照組下降了72%。究其原因，非原位和原位ThT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能與抑制劑及ThT 分子在淀粉樣纖維上的結(jié)合間的競(jìng)爭(zhēng)性抑制相關(guān)[22]。在非原位實(shí)驗(yàn)中，Aβ42-小分子伴侶體系和ThT 接觸時(shí)間較短，結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制不強(qiáng)，這導(dǎo)致了所扣除的背景值偏小。而在原位實(shí)驗(yàn)中，Aβ42-小分子伴侶-ThT 的體系混合充分，達(dá)到了較穩(wěn)定的狀態(tài)，因而所扣除的背景值更接近真實(shí)值。

圖4 各抑制劑對(duì)Aβ42 的原位ThT 熒光強(qiáng)度影響Fig.4 In situ ThT fluorescence intensity of Aβ42 with different suppressors

值得注意的是，相較于PBS 組和多酚類(lèi)抑制劑，Aβ42在小分子伴侶的存在下能更快地到達(dá)聚集穩(wěn)定期。如圖4 中黑色虛線所示，在等摩爾量多酚類(lèi)抑制劑存在下，Aβ42聚集動(dòng)力學(xué)達(dá)到穩(wěn)定期需要約4 h，而5 倍摩爾量以上的小分子伴侶可以將這一時(shí)間縮短到2 h 以內(nèi)。Stan 等[23]報(bào)道了小分子伴侶的短暫結(jié)合釋放模型(transient binding release，TBR)，相比于多酚類(lèi)抑制劑通過(guò)疏水作用力與21～30 位殘基的β 轉(zhuǎn)角結(jié)合[24]，小分子伴侶的作用更為高效，使得蛋白迅速跨越能阱到達(dá)能量最低態(tài)[25]，從而縮短了Aβ42從單體向高分子量聚集體過(guò)渡的時(shí)間。當(dāng)小分子伴侶與Aβ42的摩爾比大于5:1 后，聚集的穩(wěn)定期并沒(méi)有進(jìn)一步縮短，這可能是蛋白結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)飽和，空間位阻阻礙了小分子伴侶的進(jìn)一步作用。

3.3 小分子伴侶抑制Aβ42 自聚集形成的纖維絲

為了考察各種抑制劑對(duì)Aβ42成纖維形貌的影響，本研究利用透射電鏡觀察了老化24 h 后的Aβ42纖維樣品，結(jié)果如圖5 所示。從圖中可以看到，未添加抑制劑的Aβ42樣品視野中出現(xiàn)了大量的長(zhǎng)纖維(如圖5(a)所示)，該纖維長(zhǎng)度可達(dá)到數(shù)百納米，是典型的成熟纖維聚集體形貌；而加入了多酚類(lèi)抑制劑(姜黃素、槲皮素，如圖5(b)～(c)所示)和小分子伴侶(如圖5(d)～(e)所示)混合培養(yǎng)，Aβ42樣品視野中未出現(xiàn)長(zhǎng)纖維的形態(tài)，卻出現(xiàn)了尺度較短的短棒狀或顆粒狀的纖維形態(tài)，纖維長(zhǎng)度在50 nm 左右?？梢?jiàn)，與Aβ42自聚集形成細(xì)長(zhǎng)纖維相比，添加了抑制劑的聚集體外觀呈現(xiàn)不規(guī)則的狀態(tài)，證明小分子伴侶的加入使Aβ42穩(wěn)定在自聚集過(guò)程中未出現(xiàn)的聚集形態(tài)，從而使得聚集體形貌發(fā)生改變，最終成功抑制了Aβ42形成長(zhǎng)而細(xì)的成熟纖維絲。

3.4 小分子伴侶改變Aβ42 聚集路徑

為了進(jìn)一步分析各種抑制劑對(duì)于Aβ42聚集的抑制作用，本研究采用分析型凝膠過(guò)濾色譜探究了各種情況下Aβ42的可溶性組分分子量的分布，從而了解在各種抑制劑的作用下Aβ42聚集狀態(tài)的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示，其中選擇了牛血清白蛋白(BSA，相對(duì)分子質(zhì)量67 000，出峰時(shí)間14.8 min)和溶菌酶(lysozyme，相對(duì)分子質(zhì)量14 300，出峰時(shí)間19.6 min) 2 種蛋白質(zhì)作為色譜柱出峰時(shí)間的標(biāo)定物，以黑色箭頭標(biāo)于圖中。如圖中黑色線所示，在PBS 中，Aβ42樣品初始的可溶部分有2 個(gè)洗脫峰：第1 個(gè)峰的相對(duì)分子質(zhì)量略小于60 000，第2 個(gè)峰略大于15 000，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符[26]。從相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行分析，第1 個(gè)洗脫峰的Aβ42聚集體應(yīng)為12 聚體，相對(duì)分子質(zhì)量約為56 000(即Aβ42*56)，這是一種不會(huì)進(jìn)一步聚集而形成更大分子量聚集體的可溶性低聚體[27]；第2 個(gè)洗脫峰的Aβ42聚集體應(yīng)為三聚體，相對(duì)分子質(zhì)量約為15 000，在單體、二聚體和三聚體間存在著動(dòng)態(tài)平衡[27]，因而可以認(rèn)為該洗脫峰實(shí)際上是Aβ42單體的洗脫峰。

圖6 凝膠過(guò)濾色譜分析Aβ42 老化18 h 后可溶組分分子量分布Fig.6 Ana-SEC spectra for molecular weight distribution of Aβ42 soluble components after 18 h aging

從圖6(a)不難得出，經(jīng)過(guò)18 h 的老化后，在多酚類(lèi)抑制劑存在的情況下，Aβ42可溶性組分的總量相較于初始溶液未有明顯下降，但其中單體形式的含量顯著提升，相應(yīng)地Aβ42*56 含量下降。這說(shuō)明所選用的3 種多酚類(lèi)抑制劑能有效抑制Aβ42的聚集。這一現(xiàn)象和多酚類(lèi)抑制劑的疏水性有著重要關(guān)系，Wang 等[28]曾報(bào)道Aβ42與EGCG 并非通過(guò)特異性結(jié)合，而是通過(guò)疏水相互作用，使得Aβ42結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。改變后的寡聚體結(jié)構(gòu)具有較低的吉布斯自由能，難以發(fā)生聚集。而在小分子伴侶存在下，可溶性組分分子量的組成則呈現(xiàn)了不同的變化規(guī)律(如圖6(b)所示)。首先，單體峰完全消失，這是源于小分子伴侶能促進(jìn)蛋白向能量最低態(tài)發(fā)展的性質(zhì)；其次，相較于初始狀態(tài)，Aβ42*56 峰面積減少，并出現(xiàn)了一個(gè)更高相對(duì)分子質(zhì)量組分的洗脫峰。這一現(xiàn)象表明可能部分Aβ42*56的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其形成了高聚物。當(dāng)然，這種高相對(duì)分子質(zhì)量聚集體是否具有細(xì)胞毒性，即小分子伴侶是否成功地將毒性通路聚集體(on-pathway aggregates)轉(zhuǎn)變?yōu)榉嵌拘酝肪奂w(off-pathway aggregates)，尚需要細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.5 小分子伴侶降低Aβ42 的胞外毒性

圖7 各抑制劑對(duì)Aβ42 的體外細(xì)胞毒性影響Fig.7 Effects of different suppressors on Aβ42 in vitro cytotoxicity

通過(guò)MTT 實(shí)驗(yàn)研究了Aβ42聚集體對(duì)SH-SY5Y的細(xì)胞毒性。考察的多酚類(lèi)抑制劑濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1，選取細(xì)胞存活率最高的濃度組數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖7 所示。未添加抑制劑的對(duì)照組中，細(xì)胞存活率為67.9%；添加多酚類(lèi)抑制劑后，細(xì)胞存活率提升最多的是添加5 μmol·L-1姜黃素組，細(xì)胞存活率為80.3%。導(dǎo)致多酚類(lèi)抑制劑無(wú)法顯著降低細(xì)胞毒性的原因也源于其疏水性：一方面，疏水性這一特性使得姜黃素等抑制劑具有著良好的抑制效果；另一方面，由于多酚類(lèi)抑制劑與Aβ42的相互作用為非特異性結(jié)合，因而此能量最低形態(tài)也改變了溶液性質(zhì)，而這一改變對(duì)于細(xì)胞的功能維持是致命的。更重要的是，將寡聚體解聚確實(shí)可以使Aβ42更容易通過(guò)血液系統(tǒng)運(yùn)輸出腦部，但在抑制劑移除后，Aβ42單體的高度聚集趨勢(shì)以及本身的細(xì)胞毒性無(wú)異于在神經(jīng)細(xì)胞周?chē)惭b了大量“定時(shí)炸彈”。Selkoe[29]提出了一個(gè)典型的阿爾茨海默癥的致病模型：淀粉樣蛋白β 的雙聚體阻礙了谷氨酸在大腦內(nèi)部的重吸收，進(jìn)而使得神經(jīng)細(xì)胞周?chē)墓劝彼徇^(guò)量積累，最終導(dǎo)致神經(jīng)元激活異常，其功能被破壞。相較而言，小分子伴侶則顯著降低了Aβ42的細(xì)胞毒性，加入2.5 μmol·L-1小分子伴侶后，細(xì)胞存活率可提高到98.4%。與凝膠過(guò)濾色譜分析結(jié)果相結(jié)合，表明所得到的高相對(duì)分子質(zhì)量聚集體確實(shí)是一種非毒性通路聚集體。此外，小分子伴侶促使可溶性聚集體迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炖w維，而成熟纖維被認(rèn)為是生物學(xué)惰性的[30]，這也有助于提升細(xì)胞存活率。由于小分子伴侶蛋白具有良好的生物相容性，可以在較為溫和的條件下改變Aβ42聚集通路，使得其細(xì)胞毒性大大下降，展現(xiàn)了其作為抑制劑的安全性和有效性。

4 結(jié) 論

通過(guò)多種表征手段，對(duì)小分子伴侶抑制Aβ42聚集的過(guò)程及機(jī)理進(jìn)行了研究，結(jié)果表明小分子伴侶是一種生物相容性好、抑制作用顯著的Aβ42聚集抑制劑。其優(yōu)勢(shì)主要展現(xiàn)在以下方面：

(1) 小分子伴侶的TBR 模型不僅使得Aβ42的聚集程度降低，也使得其向聚集穩(wěn)定期發(fā)展的時(shí)間大大縮短。這縮短了過(guò)渡態(tài)中存在的高神經(jīng)毒性寡聚體的停留時(shí)間，使其迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榫邆渖飳W(xué)惰性的纖維，這是細(xì)胞存活率大幅提高的一個(gè)重要原因；

(2) 小分子伴侶引導(dǎo)活躍的Aβ42的單體或寡聚體形成低細(xì)胞毒性的聚集體，避免了Aβ42對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成2 次損傷；

(3) 相較于多酚類(lèi)抑制劑，小分子伴侶的作用條件更為溫和，生物相容性好。由于多酚類(lèi)抑制劑的作用為非特異性結(jié)合，因而其潛在的副作用是不能忽視的。而分子伴侶家族本身就廣泛存在于生物體內(nèi)，因而有望應(yīng)用于阿爾茨海默癥以及其他由蛋白錯(cuò)誤聚集造成的神經(jīng)退行性疾病的治療中。