核苷磷酸化酶酶活力檢測方法的建立

唐艷，吳濤,2*，王成，孟月

(1.通遼梅花生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 通遼 028024；2.廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司， 河北 廊坊 065001)

肌苷(inosine)，又名次黃苷、次黃嘌呤核苷，是由次黃嘌呤與核糖結(jié)合而成的核苷類物質(zhì)。生產(chǎn)方法有兩種；一種是以枯草芽孢桿菌發(fā)酵法制備[1]，另一種是以腺嘌呤及硫胺素雙重營養(yǎng)缺陷型的變異芽孢桿菌株，發(fā)酵制備得到肌苷[2-3]。肌苷能參與體內(nèi)物質(zhì)代謝和能量代謝，具有良好的藥用功效[4-5]，可治療視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮、抑郁癥[6]、糖尿病[7]，可保肝、護(hù)肝，也可搶救肝昏迷[8]。肌苷酸由化學(xué)合成、酶法合成[9]、發(fā)酵法制得[10]，具有獨(dú)特的增鮮風(fēng)味[11-13]，能有效地增強(qiáng)口感和食欲。

核苷磷酸化酶在最適宜的條件下[14-15]具有與肌苷、鳥苷共同作用的能力，生成肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉、呈味核苷酸二鈉，通過高效液相色譜方法測定其含量[16-17]。核苷酸常用作食品添加劑和醫(yī)藥中間體，其中，嘌呤核苷[18]如肌苷和鳥苷，可通過發(fā)酵及核苷的磷酸化法大規(guī)模地生產(chǎn)核苷酸。目前，主要有兩種磷酸化方法[19-20]；一種是化學(xué)磷酸化法，使用磷酸酰氯(POCl3)；另一種是酶磷酸化法，使用大腸桿菌的肌苷激酶。化學(xué)磷酸化的過程相對(duì)復(fù)雜，需要兩個(gè)反應(yīng)器，用于發(fā)酵和化學(xué)反應(yīng)；酶的磷酸化過程比較簡單，在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵。酶的磷酸化法替代化學(xué)磷酸化法生產(chǎn)核苷酸是目前的趨勢，污染小，成本低，可營造健康的生產(chǎn)作業(yè)環(huán)境。因此，核苷磷酸化酶產(chǎn)品質(zhì)量的判定十分重要，是生產(chǎn)工序的判定依據(jù)，酶活力檢測具有十分重要的意義，本文詳細(xì)地介紹了酶活力檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 藥材

肌苷、鳥苷、磷酸、三聚磷酸鈉、肌苷酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma 優(yōu)級(jí)純)、鳥苷酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma優(yōu)級(jí)純)、磷酸、乙腈(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純)。

1.1.2 器材

1200高效液相色譜儀 Agilent Technologies公司；電子天平(精度±0.00001 g)、pH計(jì) 梅特勒-托利多公司；Milli-Q超純水機(jī)、水浴鍋等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解水浴反應(yīng)

1.2.1.1 底物配制

稱取5 g肌苷(鳥苷)、5 g三聚磷酸鈉，完全溶解，用水定容至500 mL，配成10 g/L溶液，并用磷酸調(diào)pH至 4.50，作為底物。

1.2.1.2 體系預(yù)熱

分別吸取10 mL底物于試管中，置于35 ℃水浴中，預(yù)熱15 min。

1.2.1.3 酶液制備

將發(fā)酵液以10000 r/min離心5 min，去除清液與表面雜質(zhì)，將菌體配成100 g/L 酶液。

1.2.1.4 水浴操作

向試管中分別移取一定體積酶液，與底物充分混勻，進(jìn)行水浴反應(yīng)，操作要迅速。

1.2.1.5 計(jì)算肌苷酸二鈉(鳥苷酸二鈉)生成量

每10 min取樣，100 ℃滅活5 min，冷卻后稀釋25倍，進(jìn)行液相檢測，計(jì)算肌苷酸二鈉(鳥苷酸二鈉)的生成量。

1.2.2 液相檢測

1.2.2.1 流動(dòng)相配制

流動(dòng)相A：0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH為4.5±0.01)，稱取2.7218 g磷酸二氫鉀，置于1000 mL燒杯中，加入1000 mL超純水，在磁力攪拌器上攪拌至磷酸二氫鉀完全溶解，然后用磷酸調(diào)節(jié)pH 至4.5，過濾，待用。

流動(dòng)相B：乙腈。

1.2.2.2 色譜條件

色譜柱：Polaris 5 C18-A (250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B為99.5∶0.5(V/V)，等度洗脫，柱溫：40 ℃，流速：1 mL/min，紫外檢測器(λ=254 nm)，進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.2.3 前處理

a.標(biāo)品配制

配制一系列不同濃度的肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L。

b.樣品處理

將滅活的反應(yīng)液冷卻至室溫，稀釋25倍，用0.22 μm濾膜過濾，上機(jī)檢測IMP(GMP)含量。

1.2.2.4 測定

將處理好的待測樣品及不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)測序列，進(jìn)行色譜分離測定IMP(GMP)含量。

1.2.3 酶活計(jì)算

根據(jù)不同濃度的肌苷酸二鈉標(biāo)品及峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將樣品的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算(IMP)的含量(g/L)，根據(jù)外標(biāo)法測定IMP含量值，進(jìn)而計(jì)算出磷酸化酶的活力。

酶活單位：用單位時(shí)間內(nèi)單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在特定條件下，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物(或產(chǎn)物增加)所需的酶量為一個(gè)活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶反應(yīng)條件考察

分別以10 g/L肌苷和10 g/L鳥苷為底物，同時(shí)考察酶反應(yīng)時(shí)間及加酶量。

2.1.1 磷酸化酶水解肌苷結(jié)果

以10 g/L肌苷為底物，酶添加量分別為0.5，1，2 mL，反應(yīng)60 min，檢測肌苷酸二鈉含量，見表1。

由表1可知，底物濃度為10 g/L，0.5 mL反應(yīng)最佳，在60 min時(shí)沒有逆反應(yīng)，此酶具有可逆反應(yīng)，酶添加量為2 mL時(shí)，逆反應(yīng)迅速，見圖1。

圖1 IMP含量趨勢圖Fig.1 The trendgram of IMP content

2.1.2 磷酸化酶水解鳥苷結(jié)果

底物10 g/L鳥苷替換肌苷，酶添加量為0.5，1，2 mL，反應(yīng)30 min，測定鳥苷酸二鈉(GMP)含量，見表2。

表2 酶活力結(jié)果-GMP含量(g/L)Table 2 The results of enzyme activity-GMP content (g/L)

由表2可知，底物濃度為10 g/L，0.5 mL酶液反應(yīng)30 min結(jié)束，此酶與鳥苷底物反應(yīng)時(shí)，1 mL酶液在20 min開始有逆反應(yīng)，酶添加量為2 mL時(shí)，在10 min有逆反應(yīng)且反應(yīng)迅速，見圖2。

圖2 GMP含量趨勢圖Fig.2 The trendgram of GMP content

考慮底物濃度的影響，鳥苷溶解度低，10 g/L底物不能完全溶解，在水解過程中容易產(chǎn)生底物濃度不均勻，影響檢測結(jié)果，將底物濃度下降為5 g/L，酶添加量分別為0.5，1，2 mL，測定GMP含量，見表3。

表3 酶活力結(jié)果-GMP含量(g/L)Table 3 The results of enzyme activity-GMP content (g/L)

由表3可知，0.5 mL酶液反應(yīng)30 min結(jié)束，此酶與鳥苷底物反應(yīng)時(shí)，2 mL酶液10 min已經(jīng)有逆反應(yīng)且明顯，見圖3。

圖3 GMP含量趨勢圖Fig.3 The trendgram of GMP content

通過以上實(shí)驗(yàn)，考慮鳥苷比肌苷溶解度差，檢測結(jié)果存在不穩(wěn)定性，逆反應(yīng)劇烈?？膳卸ㄟx用肌苷為底物，酶解水浴反應(yīng)比鳥苷效果好，溶解迅速，結(jié)果準(zhǔn)確。水解條件：底物濃度為10 g/L肌苷，為保證無逆反應(yīng)，確定酶添加量為0.5 mL，反應(yīng)時(shí)間10 min。

2.2 菌體狀態(tài)實(shí)驗(yàn)考察

發(fā)酵菌體用水溶解制成酶液后，發(fā)現(xiàn)有黏稠、細(xì)胞裂解現(xiàn)象，因此采用增大溶液離子濃度，控制細(xì)胞裂解，為不引入其他離子，用三聚磷酸鈉溶液增大離子濃度。保持與底物濃度一致，不破壞反應(yīng)體系，采用10 g/L的三聚磷酸鈉溶液配制酶液。選取5組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比研究，測定酶活，見表4。

表4 菌體狀態(tài)及酶活力結(jié)果Table 4 The results of bacterial status and enzyme activity

增大酶液中的離子濃度，避免了細(xì)胞裂解，酶液的狀態(tài)很好，無黏稠現(xiàn)象，酶活明顯增加，可有效地避免細(xì)胞裂解現(xiàn)象，使酶反應(yīng)充分表達(dá)，有效地提升酶液質(zhì)量，提高酶液活力。因此用10 g/L的三聚磷酸鈉溶解菌體替代水溶解菌體方案，可解決菌體黏稠現(xiàn)象、細(xì)胞裂解問題。

2.3 液相條件考察

2.3.1 色譜柱選擇

采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱測定核苷酸含量，新色譜柱測定峰圖正常，由于色譜柱不耐高水相，50針后柱子逐漸塌陷，出峰異常，見圖4。

圖4 ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜峰圖Fig.4 The chromatogram of ZORBAX Eclipse XDB-C18注：鳥苷酸二鈉、肌苷酸二鈉、肌苷、鳥苷分不開。

更換色譜柱Polaris 5 C18-A(250 mm×4.6 mm)，色譜柱耐高水相，已使用2000針左右，測定核苷酸峰圖依然正常，峰形好，耐用，見圖5。

圖5 Polaris 5 C18-A 色譜峰圖Fig.5 The chromatogram of Polaris 5 C18-A注：1為鳥苷酸二鈉，2為肌苷酸二鈉，3為肌苷，4為鳥苷。

2.3.2 檢測波長的選擇

采用紫外分光光度計(jì)，在波長190～400 nm范圍內(nèi)，對(duì)肌苷、鳥苷、肌苷酸、鳥苷酸進(jìn)行掃描，最終判定檢測波長為254 nm。

2.3.3 稀釋倍數(shù)的選擇

將酶解液稀釋10，25，50，100倍上機(jī)測定，由于標(biāo)準(zhǔn)曲線中間點(diǎn)為500 mg/L，酶解反應(yīng)產(chǎn)物肌苷酸二鈉稀釋濃度在曲線中間點(diǎn)，最終判定稀釋倍數(shù)為25倍，無論酶液質(zhì)量如何，產(chǎn)物均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

2.3.4 線性及檢出限

將肌苷酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品配成不同濃度0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L，采用此色譜條件進(jìn)行色譜分離測定。結(jié)果表明：曲線為y=4237.5x-0.6885，相關(guān)線性R2=0.9999，可以看出此方法測定肌苷酸二鈉具有較好的線性相關(guān)性，見圖6，最小檢出限為0.4 mg/L。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 The standard curve

2.3.5 精密度

取5組酶解液，每組連續(xù)進(jìn)樣10次，測定IMP含量。結(jié)果表明：RSD在0.5%以內(nèi)，說明此方法測定IMP具有較高的精密度，具體結(jié)果見表5。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of precision test

2.3.6 加標(biāo)回收率及準(zhǔn)確度

取5組酶解反應(yīng)終止的稀釋液各0.5 mL，分別向其中加入0.5 g/L的IMP標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，混勻上機(jī)檢測IMP含量，同時(shí)測定加標(biāo)前樣液的IMP含量及0.5 g/L的IMP標(biāo)準(zhǔn)品含量，并計(jì)算酶活。結(jié)果表明：加標(biāo)回收率在99.6%～100%之間，0.5 g/L標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果為0.5001 g/L。結(jié)果顯示：此方法具有較高的加標(biāo)回收率及準(zhǔn)確度，能準(zhǔn)確地測定肌苷酸二鈉含量，具體結(jié)果見表6。

表6 加標(biāo)回收率及準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The results of recovery rates and accuracy test

3 結(jié)論

核苷磷酸化酶可與肌苷、鳥苷作用生成IMP、GMP，但反應(yīng)后期出現(xiàn)逆反應(yīng)，生成的產(chǎn)物能轉(zhuǎn)化為底物肌苷、鳥苷。工藝控制時(shí)，酶的添加量及反應(yīng)時(shí)間的控制非常重要，加酶量少，反應(yīng)不徹底；加酶量大，產(chǎn)生逆反應(yīng)，終點(diǎn)判定至關(guān)重要。通過上述實(shí)驗(yàn)得出最佳酶反應(yīng)條件：溫度35 ℃，pH 4.50，加酶量0.5 mL，反應(yīng)時(shí)間10 min，底物濃度10 g/L，菌體濃度100 g/L(10 g/L三聚磷酸鈉溶解菌體)，最優(yōu)液相色譜方法，采用Polaris 5 C18-A (250 mm×4.6 mm)色譜柱，以0.02 mol/L磷酸二氫鉀∶乙腈為99.5∶0.5(V/V)為流動(dòng)相，1 mL/min等度洗脫，紫外檢測器(λ=254 nm)，進(jìn)樣量2 μL。此方法測定結(jié)果準(zhǔn)確，回收率>99.5%，重復(fù)性好，RSD<0.5%，是一種有效測定磷酸化酶活力的檢測方法。核苷磷酸化酶酶活力檢測方法的建立解決了酶磷酸化工藝制取鮮味劑終點(diǎn)判定問題，能準(zhǔn)確地判定酶液產(chǎn)品質(zhì)量，應(yīng)用于生產(chǎn)，可創(chuàng)造更高價(jià)值。