人巨細(xì)胞病毒gH和PP65蛋白的B、T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位預(yù)測(cè)

張倩文 王爽 祝穎 劉澤媛 余波 王斌

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071)

人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是一種普遍存在的病原體，屬于β皰疹病毒亞科，人群中的潛在感染率很高[1]。潛伏感染幾乎不會(huì)對(duì)健康個(gè)體造成嚴(yán)重威脅，但是在免疫功能低下的人群中如器官或造血干細(xì)胞移植者中，感染了HIV或患有淋巴細(xì)胞白血病的患者中[2]，先天性感染HCMV的新生兒中[3]，則會(huì)導(dǎo)致病毒活化和各種HCMV相關(guān)疾病[4-7]，增加家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前抗HCMV的藥物副作用較大，也沒(méi)有相應(yīng)的疫苗被批準(zhǔn)上市[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)HCMV可編碼大量病毒包膜蛋白[10]，其中g(shù)B和gH蛋白是兩種主要的糖蛋白，是病毒侵入細(xì)胞的必需蛋白[11]，也是抗病毒抗體應(yīng)答的重要靶點(diǎn)，這兩個(gè)蛋白的被關(guān)注度最高[12]。目前亞單位疫苗針對(duì)gB蛋白研究較多，較少有將gH蛋白作為目標(biāo)蛋白的研究。HCMV PP65蛋白是病毒支架蛋白，是病毒被膜中含量最豐富的成分[13]，在調(diào)節(jié)病毒激酶活性以及減弱宿主抗病毒反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用[14-15]，也是T細(xì)胞應(yīng)答的主要靶點(diǎn)，在HCMV疫苗中可作為T(mén)細(xì)胞誘導(dǎo)的亞單位[16-19]。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)gH和PP65蛋白的B、T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，為HCMV亞單位疫苗的研發(fā)提供有價(jià)值的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 gH和PP65蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

首先從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中獲得gH和PP65蛋白的氨基酸序列。利用在線分析軟件SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)[20]對(duì)gH和PP65蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，計(jì)算α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲所占比例，明確β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲所在位點(diǎn)。

1.2 gH和PP65蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

利用軟件ABCpred(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)、BCPREDS(http://ailab-projects1.ist.psu.edu:8080/bcpred/index.html)[21]以及BepiPred(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)[22]預(yù)測(cè)gH和PP65蛋白的B細(xì)胞抗原表位。對(duì)3個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果中得分最高的前10個(gè)表位(如預(yù)測(cè)結(jié)果小于10個(gè)表位，則選擇所有表位)進(jìn)行重疊，結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，得到gH以及PP65蛋白的B細(xì)胞抗原表位。

1.3 gH和PP65蛋白T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

利用軟件NetMHC 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)[23-24]和IEDB(http://tools.iedb.org/mhci/)中的consensus方法[25]預(yù)測(cè)gH和PP65蛋白的CD8+T細(xì)胞抗原表位，等位基因選擇A1、A2、A3、A11和A24(CPF88.1%)[26]，對(duì)預(yù)測(cè)為strong binders和consensus score≤2的表位進(jìn)行進(jìn)一步分析。選擇兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果中的重疊表位作為蛋白的CD8+T細(xì)胞抗原表位。

再使用軟件NetMHCⅡ 2.3 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCⅡ/)[27]和NetMHCⅡpan 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCⅡpan/)[28]預(yù)測(cè)gH和PP65蛋白的CD4+T細(xì)胞抗原表位，等位基因選擇DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301和DRB1*1501[29]，對(duì)預(yù)測(cè)為strong binders的表位進(jìn)行進(jìn)一步分析。選擇兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果中的重疊表位作為蛋白的CD4+T細(xì)胞抗原表位。

1.4 抗原性分析

將上述得到的B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞的抗原表位利用軟件VaxiJen v.2.0 Server(http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)進(jìn)行抗原性分析，“TARGET ORGANISM”選擇病毒，閾值設(shè)為0.4，排除抗原性差的表位，獲得B、T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位。

2 結(jié) 果

2.1 gH和PP65蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

gH蛋白氨基酸序列(ACL51144.1)全長(zhǎng)共含有743個(gè)氨基酸；PP65蛋白氨基酸序列(ACL51152.1)全長(zhǎng)含有561個(gè)氨基酸。gH蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示，α-螺旋約占33.24%，β-折疊約占22.61%，β-轉(zhuǎn)角約占3.63%，無(wú)規(guī)卷曲約占40.51%，其中β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲所在位點(diǎn)為2～7、33～37、45～49、54～69、83～87、93～96、128～133、145～165、172～195、200～203、209～214、219～224、240～246、252～255、260～266、272～277、284～296、328～337、353～363、386～393、410～418、429～437、460～464、479～482、495～498、510～516、520～530、543～549、560～568、572～579、584～587、599～606、619～636、642～648、659～664、681～685、690～693、700～703、714～718(圖1A)。PP65蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示，α-螺旋占19.07%，β-折疊占23.71%，β-轉(zhuǎn)角占4.28%，無(wú)規(guī)卷曲占52.94%，其中β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲所在位點(diǎn)為3～9、15～20、28～39、44～46、51～54、61～74、83～88、95～109、116～125、129～143、170～179、189～196、232～239、247～252、257～271、276～279、283～288、297～300、306～312、316～325、340～343、359～368、386～407、413～418、421～441、446～473、484～489、495～497、503～512、515～519、529～551、554～561(圖1B)。

2.2 gH和PP65蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

將ABCpred、BCPREDS和BepiPred在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果重疊后共得到2個(gè)gH蛋白B細(xì)胞抗原表位，再結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲所在位點(diǎn)進(jìn)行分析，得到gH蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸位點(diǎn)為179～186，所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為KGSHTTSG；同樣通過(guò)上述3個(gè)軟件預(yù)測(cè)的PP65蛋白B細(xì)胞抗原表位共6個(gè)，再結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)分析中

A：gH蛋白，B：PP65蛋白，圖中h為α-螺旋，c為無(wú)規(guī)卷曲，e為β-折疊，t為β-轉(zhuǎn)角圖1 gH和PP65蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲所在位點(diǎn)進(jìn)行分析，得到PP65蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸位點(diǎn)分別為257～262、390～397、391～404、427～441和533～548，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別為T(mén)RNPQP、EGAAQGDD、GAAQGDDDVWTSGS、AGASTSAGRKRKSAS、PAAQPKRRRHRQDALP。

2.3 gH和PP65蛋白的T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3.1gH和PP65蛋白CD8+T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果 綜合在線軟件NetMHC 4.0 Server和IEDB中的consensus方法的預(yù)測(cè)結(jié)果，得到gH和PP65蛋白的CD8+T細(xì)胞抗原表位分別為34和10個(gè)，各等位基因及其對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)及氨基酸序列見(jiàn)表1～2。

表1 gH蛋白的CD8+T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

表2 PP65蛋白的CD8+T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3.2gH和PP65蛋白CD4+T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果 綜合在線軟件NetMHCⅡ2.3 Server和NetMHCⅡpan 4.0 Server分析蛋白的CD4+T細(xì)胞抗原表位結(jié)果，得到gH和PP65蛋白的CD4+T細(xì)胞抗原表位分別為32和8個(gè)，具體等位基因及其對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)和氨基酸序列見(jiàn)表3～4。

表3 gH蛋白的CD4+T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

表4 PP65蛋白的CD4+T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 gH和PP65蛋白各抗原表位的抗原性分析

利用軟件VaxiJen v.2.0 Server對(duì)上述得到的B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行抗原性分析，排除抗原性較差的表位后，結(jié)果顯示，gH蛋白有20個(gè)CD8+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，15個(gè)CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，1個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，PP65蛋白有8個(gè)CD8+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，8個(gè)CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，3個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，各優(yōu)勢(shì)抗原表位的等位基因及其對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)、氨基酸序列及抗原性得分見(jiàn)表5～7。

表5 gH和PP65蛋白的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位

表6 gH和PP65蛋白的CD8+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位

表7 gH和PP65蛋白的CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位

3 討 論

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在診斷試劑制備和多肽疫苗合成的前期工作中，多利用分子生物學(xué)輔助軟件進(jìn)行蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)，比用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法更省時(shí)高效。PP65蛋白中的495～503抗原表位與gB蛋白中的607～621抗原表位即是首先通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到的，然后再重組成蛋白，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[30]，證明通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)抗原表位具有一定的可靠性。

二級(jí)結(jié)構(gòu)是B細(xì)胞表位的基礎(chǔ)。在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊對(duì)蛋白質(zhì)骨架起到穩(wěn)定的作用，而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲多位于蛋白質(zhì)表面，結(jié)構(gòu)松散，易發(fā)生扭曲，成為抗原表位的可能性較大。因此本研究在預(yù)測(cè)B細(xì)胞抗原表位時(shí)以無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角作為B細(xì)胞抗原表位的候選區(qū)域。

T細(xì)胞抗原表位主要是由組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類(lèi)分子和Ⅱ類(lèi)分子提呈，并分別被CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞識(shí)別。因此，本研究在預(yù)測(cè)T細(xì)胞抗原表位時(shí)分別對(duì)CD8+和CD4+T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。

不同的抗原分子激活免疫應(yīng)答時(shí)需要不同的基因位點(diǎn)進(jìn)行提呈，但是人群HLA的遺傳背景復(fù)雜，因此本研究選擇了具有代表性的等位基因，即5個(gè)MHC-Ⅰ類(lèi)分子等位基因A1、A2、A3、A11和A24以及8個(gè)MHC-Ⅱ類(lèi)分子等位基因DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301以及DRB1*1501[26]，預(yù)測(cè)了不同等位基因的抗原表位，克服了HLA的遺傳限制，實(shí)現(xiàn)了較高的人群覆蓋率。為避免單獨(dú)一種分析軟件預(yù)測(cè)抗原表位的局限性和提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究采用了多個(gè)生物信息學(xué)的軟件同時(shí)進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)，以各結(jié)果的重疊表位作為優(yōu)勢(shì)抗原表位。

研究發(fā)現(xiàn)，HCMV的gB和gH蛋白是抗病毒抗體應(yīng)答的重要靶點(diǎn)，但Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)顯示，gB蛋白亞單位疫苗與佐劑MF259(為水包角鯊烯乳劑配方，由角鯊烯、Tween280和Span285等組成)在體內(nèi)產(chǎn)生的抗體應(yīng)答短暫，僅能夠維持幾個(gè)月[31]，因此本研究著重分析了gH蛋白的抗原表位。PP65是CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的主要識(shí)別位點(diǎn)，在細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究目的是通過(guò)生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)出產(chǎn)生抗體應(yīng)答的重要靶點(diǎn)蛋白gH蛋白和產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的PP65蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位，以期能夠用于HCMV亞單位疫苗的研究，但這些表位是否可以產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，還需要通過(guò)體外和體內(nèi)的免疫激活實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，gH蛋白有20個(gè)CD8+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，15個(gè)CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，1個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，PP65蛋白有8個(gè)CD8+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，8個(gè)CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，3個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，且都具有良好的抗原性。