吲哚-3-甲醇對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖與遷移能力的影響及其機制

周娜 丁偉 宋金蓮 王軍 鄭文祥 侯琳

(1 青島大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山東 青島 266021； 2 青島市婦女兒童醫(yī)院)

神經(jīng)母細胞瘤(NB)又稱交感神經(jīng)母細胞瘤[1]，是兒童臨床最常見的顱外惡性實體瘤[2]。目前，臨床上針對惡性程度高、發(fā)生轉移早的高危NB患者常采用超大劑量聯(lián)合化療的治療手段，但是臨床常用的化學合成藥物具有毒副作用大、效果不佳、易復發(fā)及伴有明顯的骨髓抑制和較高的感染發(fā)生率等缺點[3]，一定程度上限制了其臨床應用。天然化合物可靶向殺傷腫瘤細胞，毒副作用較小，一直以來被作為新藥開發(fā)的先導化合物的優(yōu)質來源[4-7]，為腫瘤的臨床治療提供了新的治療思路。

組蛋白去甲基化酶1(LSD1)是首個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白特異性去甲基酶，為黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性的單胺氧化酶家族成員之一[8]，能夠特異性地去除組蛋白第三亞基四號賴氨酸(H3K4)以及組蛋白第三亞基9號賴氨酸(H3K9)的單雙甲基化[9]。LSD1在上皮間質轉化(EMT)[10]、細胞分化[11]及增殖[12]等過程中發(fā)揮著重要的生物學作用。KRAAL等[13]研究證明，在許多腫瘤組織中LSD1高表達。目前，臨床上針對實體瘤的LSD1抑制劑的需求在很大程度上尚未得到滿足。

近年來隨著對吲哚類化合物的深入研究，發(fā)現(xiàn)含氮雜環(huán)衍生物生物堿在生物體內發(fā)揮著愈加重要的作用。吲哚-3-甲醇(I3C)是在花莖甘藍以及抱子甘藍等十字花科蔬菜中廣泛存在的抗腫瘤天然成分[14]。張麗[15]研究證明，吲哚醌類化合物對NB細胞的增殖與遷移具有抑制作用，在臨床NB患者中LSD1高表達。另外，吲哚醌類化合物為內源性的單胺氧化酶(MAO)抑制劑[16]，LSD1為單胺氧化酶，I3C為吲哚類化合物，且I3C在NB細胞增殖與遷移方面的作用未見報道。因此，本研究以不同濃度的I3C處理SH-SY5Y細胞，探討I3C對NB細胞增殖與遷移能力的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

NB細胞系SH-SY5Y由本課題組提供；CCK8試劑盒以及DMSO購自北京索萊寶科技有限公司；I3C購自美國MedChemExpress(MCE)公司；胎牛血清購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司；DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基購自福州南江生物科技有限公司；Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ購買于湖南艾科瑞生物工程有限公司；熒光定量PCR Mix購買于北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司；GAPDH、LSD1、H3K4me1/2單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng) SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.15的胎牛血清及體積分數(shù)0.01青鏈霉素混合溶液的DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)至匯合度達40%～60%時進行后續(xù)實驗。

1.2.2CCK8實驗檢測SH-SY5Y細胞活力及半數(shù)致死濃度(IC50值) 將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，胰酶消化后接種于96孔板中，每孔約2 000個細胞，待細胞完全貼壁并進入對數(shù)生長期后，分別加入I3C使其終濃度為0、50、100、150、200、300、500 μmol/L，每種濃度設5個復孔，邊緣空孔加入無菌PBS以減少水分蒸發(fā)。藥物處理48 h后，每孔加入CCK8溶液10 μL，再次放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。置于酶標儀上測定波長450 nm處各孔的吸光度(A)值，并計算細胞活力及IC50值。

1.2.3劃痕實驗檢測SH-SY5Y細胞的遷移能力 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，消化并接種于6孔板中，每孔約50 000個細胞，待細胞的匯合度達80%～90%時，用200 μL槍頭垂直于6孔板刮擦細胞以產生劃痕區(qū)域，用PBS輕輕沖洗掉刮下細胞及細胞碎片，然后加入2 mL無血清培養(yǎng)基，以CCK8實驗結果得出的IC50值為依據(jù)，將細胞分別加入終濃度為0、30、60、90 μmol/L的I3C(分別為A、B、C、D組)作用48 h，分別于0、48 h時顯微鏡下拍照，記錄劃痕愈合情況，實驗重復3次，取均值。

1.2.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術檢測SH-SY5Y細胞中LSD1 mRNA的相對表達量 采用Trizol法分別提取I3C作用48 h后A～D組中SH-SY5Y細胞的總RNA，測定各組RNA濃度與純度，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR。以GAPDH為內參基因，根據(jù)試劑盒說明書配制反應體系，每組樣品設置3個復孔，采用2-△△CT法計算各組LSD1 mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.5Western Blot實驗檢測SH-SY5Y細胞中LSD1、H3K4me1及H3K4me2蛋白的相對表達量采用RIPA法(加PMSF和蛋白酶磷酸酶抑制劑)提取I3C作用48 h后A～D組SH-SY5Y細胞的蛋白，用BCA法進行蛋白定量，加入5×loading buf-fer于水中煮沸10 min變性；配制聚丙烯酰胺凝膠，加入25 μg的蛋白樣品至凝膠孔內，邊緣空加入1×蛋白上樣緩沖液；進行SDS蛋白電泳，PVDF轉膜，以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，然后分別以LSD1、H3K4me1以及H3K4me2蛋白(其中H3K4me1、H3K4me2蛋白為LSD1的酶底物)單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，并以GAPDH作為內參照，TBST洗膜后二抗孵育1 h，TBST洗膜，顯影拍照，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達量，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。實驗重復3次，結果取均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用Graphpad Prism 6軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組SH-SY5Y細胞增殖活力比較

CCK-8試劑盒檢測結果顯示，當I3C濃度為0、50、100、150、200、300、500 μmol/L時，SH-SY5Y細胞的增殖活力分別為(99.83±0.09)%、(53.11±1.10)%、(35.59±0.75)%、(33.85±0.87)%、(26.40±0.71)%、(24.43±0.30)%、(13.01±0.20)%。隨著I3C濃度的遞增，SH-SY5Y細胞的增殖活力明顯下降(F=1 823.19，P<0.05)。計算得出I3C作用于SH-SY5Y細胞48 h的IC50值為121.00 μmol/L，即100 μmol/L濃度以內的I3C對細胞沒有明顯毒性，因此后續(xù)實驗設定的I3C至終濃度為0、30、60、90 μmol/L。

2.2 各組SH-SY5Y細胞遷移能力比較

劃痕實驗結果顯示，I3C作用SH-SY5Y細胞48 h后，A～D組的細胞遷移率分別為0.28±0.01、0.19±0.01、0.11±0.01、0.07±0.01，隨著I3C濃度的增高，SH-SY5Y細胞的遷移能力逐漸降低(F=388.47,P<0.05)，各組間比較差異均具有顯著性(t=8.86～33.43,P<0.05)。

2.3 各組細胞中LSD1 mRNA的相對表達量比較

不同濃度I3C處理SH-SY5Y細胞48 h以后，RT-qPCR結果顯示，A～D組細胞中LSD1 mRNA相對表達量分別為1.03±0.04、0.71±0.16、0.35±0.04、0.02±0.01，隨著I3C濃度的增高，SH-SY5Y細胞中LSD1 mRNA的相對表達量逐漸下降(F=27.67,P<0.05)，各組間比較差異均有顯著性(t=1.95～27.93,P<0.05)。

2.4 各組細胞中LSD1及H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量的影響

Western Blot實驗結果顯示，A～D組LSD1蛋白相對表達量隨著I3C濃度的增高明顯下降(F=522.41,P<0.05)，各組間比較差異均有顯著性(t=4.16～56.28,P<0.05)。H3K4me1以及H3K4me2蛋白的相對表達量則隨著I3C濃度的增高明顯升高(F=36.53、54.60，P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞中LSD1、H3K4me1、H3K4me2蛋白的相對表達量比較

3 討 論

目前，隨著腫瘤病理學、細胞生物學、腫瘤基因學等研究的進展，發(fā)現(xiàn)作用于特定靶點的高效、低毒、特異性強的新型抗腫瘤藥物己成為當今抗腫瘤藥物研究的重要方向。近年來，靶向作用腫瘤細胞而對正常細胞損傷較輕的天然小分子化合物類藥物成為研究熱點，尤其如長春堿、長春新堿等毒副作用較低的天然吲哚化合物在抗腫瘤中的應用，日漸引起關注，已成為了抗腫瘤藥物研究的熱點[17]。I3C作為天然吲哚類化合物之一，是近年來研究較多的天然抗腫瘤活性小分子化合物。I3C可以通過多種直接或間接的方式與雌激素受體(ER)、芳烴羥化酶受體(AhR)、轉錄因子Sp1結合，調節(jié)與DNA損傷修復、細胞凋亡及周期調控相關基因的表達[18]。目前臨床上I3C對于復發(fā)性呼吸器多發(fā)乳頭瘤的治療尚未發(fā)現(xiàn)即時或遠期的毒副作用，證明其安全性是較高的。

NB一般體積較大、惡性程度高、生長迅速、轉移性高，常在發(fā)病較短時間內沖破包膜，侵及周圍組織，或經(jīng)血液及淋巴轉移[19]。因此，針對NB增殖能力強、易轉移的特質，本研究將梯度濃度的I3C作用于NB細胞系SH-SY5Y，實驗結果顯示I3C作用于SH-SY5Y細胞48 h后，細胞的活力及遷移能力明顯下降。大量研究證實，LSD1功能障礙能抑制急性淋巴白血病[20]、肺腺癌[21]、乳腺癌[22]等細胞的增殖。因此LSD1可作為較理想的篩選抗腫瘤藥物的關鍵靶點[23]。為探討I3C是否通過調節(jié)LSD1對NB細胞增殖與遷移發(fā)揮作用，本研究RT-qPCR技術以及Western Blot實驗結果顯示，I3C能夠顯著地降低NB細胞中LSD1 mRNA和蛋白的相對表達量。另外，H3K4me1、H3K4me2作為基因轉錄激活的標志物是LSD1的主要底物。LSD1可與CoREST復合物結合后，進而脫去靶基因啟動子處H3K4me1、H3K4me2甲基化修飾，從而將染色質改變?yōu)橐种菩誀顟B(tài)，最終抑制該基因的表達[24]。本研究通過Western Blot實驗得出I3C作用于SH-SY5Y細胞后H3K4me1、H3K4me2蛋白的相對表達量增高，提示I3C對NB增殖與遷移的作用可能是通過調節(jié)LSD1實現(xiàn)的，為LSD1抑制劑的研究拓展了思路。

總之，本研究結果顯示，I3C可能具有抑制SH-SY5Y細胞增殖與遷移的能力，I3C可能通過調節(jié)LSD1的表達對NB細胞的增殖與遷移產生影響。